陳家亮，周向東，陳小妹，李 琪，劉 鋒

(1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,?？?570102;2.急救與創(chuàng)傷研究教育部重點實驗室，?？?571199;3.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科，?？?570102)

哮喘屬異質(zhì)性疾病，每年有25萬人因哮喘而死，且中國哮喘患者約3 000萬人，已成為影響公共健康隱患[1]。哮喘由多因素引起，且由多種細胞和細胞組分參與，常伴隨炎性反應、氣道高反應性、氣道重塑，導致上皮細胞黏液化、杯狀細胞增生等癥狀，從而造成氣流不暢、氣道阻力過大，影響肺正常生理功能[2-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白翻譯、修飾、正確折疊等過程中均發(fā)揮重要作用，當機體處于應激狀態(tài)時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白異常激活狀態(tài)，在哮喘中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)影響氣道重塑[5]、氣道黏液高分泌[6]，推測抑制ERS可緩解哮喘。本研究采用卵清清蛋白(OVA)+氫氧化鋁制備哮喘模型，探究哮喘模型中ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)處理對哮喘的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選擇無特定病原體(SPF)級雌性C57BL/6小鼠24只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。8周齡、體重20～22 g，均在海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心(12 h/12 h)光照/黑暗、溫度(25±1)℃、濕度(50±5)%環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)。本實驗經(jīng)海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會審核并批準(倫理批準文號：2018LL0129)。

1.1.2藥品、試劑及儀器

OVA、4-PBA購自美國Sigma公司(CAS號：9006-59-1、E7144)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號：C0105)；馬松(Masson)染色試劑盒、過碘酸雪夫(PAS)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：G1340、G1285)；小鼠白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，一抗兔抗肌醇需求酶1α(IRE1α)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、ERS相關(guān)基因C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)購自英國Abcam公司(貨號：ab203360、ab208348、ab48187、ab37149、ab11419、ab108615)。蛋白凝膠成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple公司(型號：FluorChem)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及模型制備

實驗分為對照組、模型組、ERS抑制劑組，每組8只。除對照組外，其余各組在第1、7、14天腹腔注射200 μL OVA 20 μg和氫氧化鋁2 mg的混合液致敏，對照組在同一天腹腔注射200 μL生理鹽水。自第21天起，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，OVA 40 μg滴鼻激發(fā)哮喘發(fā)作，連續(xù)6周，每周3次，對照組則在相同時間生理鹽水滴鼻。從第21天起ERS抑制劑組每次激發(fā)前30 min灌胃0.35 mg/g 4-PBA，對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

1.2.2樣本收集

最后1次激發(fā)24 h后，立即處死小鼠，22G留置針氣管插管并固定，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，行左側(cè)肺支氣管肺泡灌洗0.8 mL PBS灌洗肺3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，左肺迅速置于4%多聚甲醛中固定，右肺置于-80 ℃冰箱待檢。

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1.2.3BALF細胞計數(shù)

1 500 r/min、4 ℃離心BALF 10 min，取出上清液，1 mL PBS重懸細胞，涂片后光學顯微鏡下進行細胞總數(shù)計數(shù)，并計數(shù)200個左右白細胞中嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞個數(shù)。

1.2.4ELISA檢測BALF中IL-6、TNF-α水平

嚴格按照小鼠IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明檢測BALF中IL-6、TNF-α水平。

1.2.5HE染色檢測肺組織形態(tài)情況

4%多聚甲醛固定、石蠟包埋組織，肺門水平橫切制切片(厚度5 μm)。每組取部分切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、梯度乙醇脫水、HE染色，經(jīng)二甲苯透明、自然干燥后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.6Masson染色檢測肺組織膠原沉積情況

每組取部分切片，脫蠟至水，經(jīng)Masson復合染液染色、0.2%醋酸清洗，5%鎢鉬酸染色、0.2%醋酸清洗，苯胺藍染色、0.2%醋酸水洗，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察膠原沉積變化。

1.2.7PAS染色檢測肺組織杯狀上皮細胞增生情況

每組取部分切片，脫蠟至水，經(jīng)3%醋酸洗、阿利新藍染、蒸餾水去浮、0.5%過碘酸染、蒸餾水去浮，70%乙醇清洗，Schiff染色，蘇木素染核，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察肺組織杯狀上皮細胞增生情況。

1.2.8Western blot檢測肺組織中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表達情況

-80 ℃取部分肺組織，蛋白裂解液裂解提取肺組織總蛋白，凝膠電泳分離蛋白、PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉，加入對應一抗IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78、GAPDH，4 ℃孵育過夜；加入二抗室溫孵育1 h。蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和定量分析。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠BALF中細胞計數(shù)情況

與對照組比較，模型組小鼠BALF中細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數(shù)量升高(P<0.05)；與模型組比較，ERS抑制劑組小鼠BALF中細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數(shù)量降低(P<0.05)，見表1。

表1 3組小鼠BALF中細胞計數(shù)比較

2.2 3組小鼠BALF中IL-6、TNF-α表達情況

與對照組比較，模型組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，ERS抑制劑組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 3組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平比較

2.3 3組小鼠肺組織形態(tài)、膠原沉積及杯狀上皮細胞增生情況比較

對照組小鼠氣道及肺血管正常、膠原沉積較少，幾乎看不到杯狀上皮細胞增生；模型組小鼠肺血管周圍聚集大量炎癥細胞、肺泡間隔增厚、結(jié)構(gòu)破壞、平滑肌增厚，膠原纖維沉積明顯增加，杯狀細胞數(shù)量明顯增多；與模型組比較，ERS抑制劑組小鼠肺血管周圍炎癥細胞數(shù)量減少、肺泡間隔有所增加，但結(jié)構(gòu)破壞仍嚴重，膠原纖維沉積、杯狀細胞數(shù)量均降低，見圖1。

圖1 3組小鼠肺組織氣道重塑、膠原沉積、杯狀上皮細胞增生情況(×200)

2.4 3組小鼠肺組織中相關(guān)蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，ERS抑制劑組小鼠肺組織中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表達水平降低(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 3組小鼠肺組織中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表達水平比較

圖2 3組小鼠肺組織中相關(guān)蛋白表達水平

3 討 論

氣道黏液高分泌導致氣道腺體和杯狀細胞產(chǎn)生過量的黏液，黏液量過多長期聚集可阻塞氣道，導致氣流受限，引起通氣功能障礙；黏液量過多影響纖毛清除和局部防御功能，若異物或病原菌滯留在肺和氣道內(nèi)，會增加呼吸道感染風險[7]。在本研究中哮喘模型小鼠肺組織中出現(xiàn)炎性反應、平滑肌細胞增厚、膠原沉積等現(xiàn)象，氣道重塑是氣道炎癥、組織損傷等病理變化后出現(xiàn)的不正常修復，促使氣道壁結(jié)構(gòu)變化，包括氣道上皮細胞損傷脫落、黏膜下層杯狀細胞化生、平滑肌細胞增生和肥大、氣道壁增厚等病理變化[8]。哮喘小鼠肺組織可能會增加氣道重塑的風險；肺組織分泌更多的杯狀細胞，而杯狀細胞分泌黏液影響氣道功能；BALF中細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數(shù)量均升高，哮喘小鼠出現(xiàn)病理損傷，涉及多種細胞參與，通過細胞水平參與氣道黏液高分泌、氣道重塑等生理病理過程[9]，哮喘小鼠病理性損傷，細胞均出現(xiàn)差異，加重疾病進程。

哮喘模型小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平升高，而IL-6、TNF-α均是由單核細胞分泌的促炎因子，在氣道炎癥中參與炎性反應，促進炎癥細胞的合成和炎癥介質(zhì)的釋放[10]。IL-6分泌升高可促進嗜酸粒細胞的分泌，增加炎性反應和漿細胞釋放免疫球蛋白，而免疫球蛋白可促進組胺、白三烯、血小板活化因子、前列腺素等過敏介質(zhì)的釋放，引起支氣管痙攣，造成血管通透性和黏液分泌增加，造成黏膜水腫、增加氣道重塑可能性，加重哮喘[11]。TNF-α調(diào)控細胞因子、黏液分子和黏液素等的分泌和表達，發(fā)揮促炎因子作用[12]。提示哮喘小鼠炎癥因子分泌升高促進炎性反應，進而促進嗜酸性粒細胞、黏液分子、黏液素等的分泌，并促進過敏介質(zhì)的釋放，誘導氣管痙攣，增加血管通透性促進氣管重塑，增加黏液分泌導致氣道黏液高分泌，誘導氣流受阻同時增加呼吸道感染疾病風險。

哮喘模型小鼠肺組織中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表達水平升高，ERS在生理病理情況下出現(xiàn)，會引起未折疊蛋白反應[13]，未折疊蛋白反應可參與跨膜蛋白IRE1α、ATF6、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶3條信號通路。正常狀態(tài)下，這3條信號通路相關(guān)蛋白與CHOP、GRP78結(jié)合處于非激活狀態(tài)[14]；在病理狀態(tài)下，ERS可促進CHOP表達升高進而引起細胞代謝紊亂，導致細胞凋亡[15]。激活CHOP、GRP78可促進細胞外基質(zhì)中膠原組織沉積進而基膜增厚，促進細胞代償性恢復正常功能，加速氣道重塑和氣道狹窄[16-17]。上述研究提示，哮喘小鼠病理狀態(tài)下IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78處于激活狀態(tài)，肺組織中ERS嚴重，此時未折疊蛋白參與跨膜蛋白信號通路反應，激活CHOP、GRP78蛋白表達，促進細胞外基質(zhì)中膠原組織的大量沉積和基膜增厚，促進氣道重塑，加速疾病嚴重。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，ERS抑制劑組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平降低，可減輕細胞分泌過多的嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞，抑制細胞外基質(zhì)中膠原組織沉積和基膜增厚現(xiàn)象，實現(xiàn)對疾病的保護。在哮喘中抑制ERS對于緩解疾病具有重要意義。

綜上所述，抑制ERS可降低氣道黏液高分泌和氣道重塑，實現(xiàn)對哮喘的保護。本文首次驗證抑制ERS可保護哮喘，可為臨床上哮喘的靶向治療提供參考依據(jù)。但影響哮喘機制較復雜，進一步發(fā)現(xiàn)影響疾病因素對于緩解疾病意義重大，亦是本研究進一步研究重點。