趙呈龍，李 力，王玉波，韓 睿，何 勇

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400042)

肺癌位居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病首位，半數(shù)以上肺癌患者確診時(shí)已經(jīng)為晚期，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占其85%以上[1]。繼化療及靶向治療后，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)為代表的新型腫瘤免疫治療已成為NSCLC治療的重要手段之一,但僅有20%的晚期NSCLC患者對(duì)免疫治療有應(yīng)答[2-3]。因此，發(fā)現(xiàn)有效的生物標(biāo)志物指導(dǎo)應(yīng)用ICIs顯得尤為重要。程序性細(xì)胞死亡受體-配體1(PD-L1)是目前唯一被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于篩選NSCLC免疫治療優(yōu)勢(shì)人群的生物標(biāo)志物[4-6]，腫瘤突變負(fù)荷(TMB)同樣可成為ICIs的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物[7-8]，二者聯(lián)合應(yīng)用或?qū)⒂懈鼜?qiáng)的ICIs療效預(yù)測(cè)能力[9-10]。同時(shí)，關(guān)于ICIs單藥和聯(lián)合化療方案的選擇，已成為臨床探索的新熱點(diǎn)，能否通過PD-L1和TMB指導(dǎo)ICIs單藥或聯(lián)合治療方案亦缺少研究報(bào)道。本文擬聯(lián)合基線肺腫瘤組織PD-L1表達(dá)和下一代測(cè)序(NGS)大panel檢測(cè)肺腫瘤組織TMB，尋找預(yù)測(cè)肺癌免疫療效的獲益因素，并指導(dǎo)ICIs單藥或聯(lián)合治療方案在NSCLC患者中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2017年8月至2020年6月在本院呼吸與危重癥科接受免疫治療的晚期肺癌患者。采集患者年齡、性別、腫瘤病理類型、轉(zhuǎn)移部位、TNM分期、PD-L1表達(dá)及TMB水平等臨床基本特征，以及免疫治療的用藥方式、療效和預(yù)后。采用查閱病案資料、門診復(fù)診及電話隨診等方式進(jìn)行隨訪。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床信息完整，根據(jù)組織病理學(xué)符合NSCLC的診斷；(2)按照第八版國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，診斷為Ⅲ期或Ⅳ期NSCLC；(3)一線或非一線接受ICIs(納武單抗或派姆單抗)單藥治療或聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療；(4)免疫治療前同時(shí)接受組織PD-L1檢測(cè)及NGS大panel檢測(cè)TMB水平；(5)美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)體能狀況(PS)評(píng)分0～2分；(6)除死亡導(dǎo)致隨訪截止外，隨訪時(shí)間均超過6個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)小細(xì)胞肺癌；(2)接受ICIs治療少于2周期；(3)合并其他惡性腫瘤。本研究獲得陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-56)。最終納入44例接受ICIs治療的NSCLC患者，無失訪病例，中位隨訪時(shí)間13.40個(gè)月，四分位數(shù)間距(IQR)為9.30～17.70個(gè)月。至隨訪結(jié)束時(shí)，23例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展(PD)，其中20例已死亡，余21例仍在接受免疫治療。44例患者中31例接受派姆單抗，13例接受納武單抗。44例NSCLC患者的基本臨床特征，見表1。

表1 44例NSCLC患者的基本臨床特征

1.2 方法

1.2.1PD-L1表達(dá)及TMB檢測(cè)方法

在患者進(jìn)行免疫治療前1周，采用支氣管鏡活檢、胸腔鏡活檢或經(jīng)皮肺穿刺活檢取得足量腫瘤組織，并由10%甲醛溶液保存待檢測(cè)。(1)腫瘤組織PD-L1表達(dá)采用PD-L1免疫組化22C3試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，腫瘤細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)(TPS)由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行判讀得出，根據(jù)TPS將PD-L1表達(dá)分為PD-L1≥50%(A組,n=16)，PD-L1 1%～<50%(B組,n=14)，PD-L1<1%(C組,n=14)3個(gè)等級(jí)；(2)已有研究證實(shí)，基于NGS大panel檢測(cè)的TMB可替代基于全外顯子組測(cè)序(WES)檢測(cè)的TMB[11-12]。本研究中，由思路迪?對(duì)腫瘤組織437個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，覆蓋基因捕獲區(qū)域大于1百萬堿基(Mb)。腫瘤組織TMB根據(jù)所測(cè)靶向編碼區(qū)每Mb的體細(xì)胞突變數(shù)目，包括點(diǎn)突變和插入缺失，去除熱點(diǎn)突變，包含同義突變進(jìn)一步分析所得。思路迪?數(shù)據(jù)庫對(duì)TMB做分瘤種排序，并按照四分位來劃分cut-off值界定TMB高低，將TMB分為高低兩組，位于0～50%為低TMB組(n=16)，>50%～100%為高TMB組(n=28)。根據(jù)PD-L1表達(dá)聯(lián)合TMB結(jié)果將患者分為4組：PD-L1≥50%高TMB組(Ⅰ組，n=11),PD-L1≥50%低TMB組(Ⅱ組，n=5)，PD-L1<50%高TMB組(Ⅲ組，n=17)，PD-L1<50%低TMB組(Ⅳ組，n=11)?；颊吣挲g、臨床分期、病理分型、治療方式、治療藥物在PD-L1及TMB各組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 患者基本臨床特征在PD-L1及TMB各組間的均衡性分析[n(%)]

1.2.2觀察指標(biāo)

(1)參照實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)1.1版評(píng)價(jià)療效：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)。(2)客觀有效率(ORR)=[(CR+PR)/總病例數(shù)]×100%，疾病控制率(DCR)=[(CR+PR+SD)/總病例數(shù)]×100%。(3)持續(xù)臨床獲益(DCB)，為接受免疫治療后大于或等于6個(gè)月未出現(xiàn)PD；非持續(xù)臨床獲益(NDB)，為接受免疫治療后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)PD[13]。(4)無進(jìn)展生存期(PFS)，為ICIs開始治療至患者病情進(jìn)展或任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間；總生存期(OS)，為自ICIs開始治療至任何原因?qū)е禄颊咚劳龅臅r(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件及GraphPad Prism7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，log-rank檢驗(yàn)比較組間生存差異，Cox回歸模型進(jìn)行多因素生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ICIs療效的影響因素

Kaplan-Meier單因素分析顯示，患者性別、年齡、臨床分期、治療方式、免疫治療藥物與PFS、OS不相關(guān)(P>0.05)，PD-L1表達(dá)與PFS、OS呈正相關(guān)(P<0.05)，TMB水平與PFS呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。將PD-L1表達(dá)、TMB水平、TNM臨床分期、治療方式(ICIs單藥或聯(lián)合化療)、免疫治療藥物納入Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)和TMB是PFS的獨(dú)立影響因素，PD-L1≥50%患者的PD風(fēng)險(xiǎn)低于PD-L1<50%(P<0.05)，高TMB組患者的PD風(fēng)險(xiǎn)低于低TMB組(P<0.05)；PD-L1表達(dá)是OS的獨(dú)立影響因素，PD-L1≥50%患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)低于PD-L1<50%患者(P<0.05)，見表4。

表3 Kaplan-Meier單因素分析ICIs療效的影響因素

表4 Cox多因素回歸分析ICIs療效的影響因素

2.2 PD-L1表達(dá)與ICIs療效的關(guān)系

A組患者ORR，DCR最高(81.3%，93.8%)。隨著PD-L1表達(dá)的降低，3組患者的DCB占比逐漸減少，A組DCB率明顯高于C組(87.5%vs. 42.9%,P<0.05)。生存分析結(jié)果顯示，3組不同PD-L1表達(dá)患者的PFS及OS生存曲線不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PFS,χ2=9.511，P<0.05；OS,χ2=9.462，P<0.05)，A組患者的PFS及OS生存曲線優(yōu)于B、C組，見圖1。

圖1 PD-L1表達(dá)與ICIs療效的關(guān)系

2.3 TMB與ICIs療效的關(guān)系

高TMB組的ORR高于低TMB組(75.0%vs. 31.3%，P<0.05)，高TMB組的DCB率高于低TMB組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(75.0%vs. 56.3%，P>0.05)。生存分析結(jié)果顯示，高TMB組的PFS生存曲線明顯優(yōu)于低TMB組(χ2=5.122，P<0.05)；高TMB組的OS生存曲線優(yōu)于低TMB組，但未見明顯差異(χ2=3.798,P=0.051)，見圖2。

圖2 TMB水平與ICIs療效的關(guān)系

2.4 PD-L1表達(dá)聯(lián)合TMB與ICIs療效的關(guān)系

Ⅰ組的ORR、DCR及DCB率最高，分別為81.8%、100%、90.9%；Ⅱ組和Ⅲ組的ORR、DCR及DCB率略有下降；Ⅳ組的DCR及DCB率最低，分別為72.7%和45.5%，同時(shí)該組的ORR最低(9.1%)，明顯低于其他組(P<0.05)。生存分析結(jié)果顯示，4組患者的PFS及OS生存曲線差異明顯(PFS,χ2=12.350，P<0.05；OS,χ2=9.274，P<0.05)，Ⅰ組的PFS及OS生存曲線最優(yōu)，Ⅳ組的PFS及OS生存曲線最差，見圖3。根據(jù)PD-L1聯(lián)合TMB的分組，對(duì)ICIs單藥組(單藥組)與ICIs聯(lián)合化療組(聯(lián)合組)做進(jìn)一步分析。年齡、臨床分期、病理分型、治療藥物在單藥組與聯(lián)合組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。在全組人群中，單藥組的ORR、DCR及DCB率與聯(lián)合組相近(50.0%vs.64.3%,75.0%vs. 89.3%,56.3%vs. 75.0%,P>0.05),兩組患者的PFS及OS生存曲線比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。在Ⅳ組患者中，單藥組的最佳療效未見PR，其ORR及DCR均低于聯(lián)合組(0vs. 16.7%；40%vs. 100%)；單藥組的DCB率明顯低于聯(lián)合組(0%vs. 83.3%,P<0.05)；聯(lián)合組的PFS及OS生存曲線明顯優(yōu)于單藥組(PFS,χ2=9.744，P<0.05；OS,χ2=5.276，P<0.05)，見圖5。在Ⅰ組患者中，ICIs單藥和ICIs聯(lián)合化療的ORR、DCR、DCB率、PFS及OS生存曲線比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

圖3 PD-L1表達(dá)聯(lián)合TMB水平與ICIs療效的關(guān)系

表5 ICIs單藥組與ICIs聯(lián)合化療組的均衡性分析

圖4 不同用藥方式與全組患者ICIs療效的關(guān)系

圖5 用藥方式與Ⅳ組患者ICIs療效及預(yù)后的關(guān)系

圖6 用藥方式與Ⅰ組患者ICIs療效與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

腫瘤免疫治療發(fā)展的突飛猛進(jìn)，開啟了NSCLC治療模式的新篇章。但是只有一小部分NSCLC患者能從免疫治療中獲益[2]。因此在精準(zhǔn)醫(yī)療的時(shí)代，篩選出適宜人群是NSCLC免疫治療的關(guān)鍵。

PD-L1是目前公認(rèn)的用來預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療效果的生物標(biāo)志物。KEYNOTE-024等諸多研究均證實(shí)PD-L1表達(dá)對(duì)免疫治療療效的預(yù)測(cè)效能，進(jìn)而PD-L1免疫組化檢測(cè)被FDA批準(zhǔn)作為PD-1/PD-L1抑制劑的伴隨診斷，并寫入了美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[4-5]。KEYNOTE-189、CheckMate-057、ATLANTIC、JAVELIN Lung 200等研究的結(jié)果均表明，隨著PD-L1表達(dá)的不斷增高，NSCLC患者更能從ICIs治療中獲益[14-17]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TMB可作為預(yù)測(cè)NSCLC患者ICIs療效的生物標(biāo)志物[13,18-19]。一項(xiàng)前瞻性臨床研究(CheckMate-227)結(jié)果顯示，在接受ICIs聯(lián)合治療的患者中，高TMB組的PFS明顯優(yōu)于低TMB組，預(yù)示TMB可預(yù)測(cè)ICIs療效[8]。CheckMate 568研究也證實(shí)了TMB對(duì)ICIs療效的預(yù)測(cè)價(jià)值[20]。紀(jì)念斯隆-凱特林癌癥中心報(bào)道了迄今為止最大的關(guān)于TMB預(yù)測(cè)免疫療效的研究，首次在多癌種中證實(shí)高TMB人群接受ICIs具有更高的總存活率，進(jìn)一步證實(shí)TMB是預(yù)測(cè)NSCLC免疫治療效果的生物標(biāo)志物[21]。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了PD-L1表達(dá)和TMB可作為ICIs療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

上述研究表明，PD-L1高表達(dá)或高TMB患者更能從免疫治療中獲益，但由于二者均有一定的局限性，單獨(dú)依賴其中一種生物標(biāo)志物不能完全有效地篩選出免疫治療優(yōu)勢(shì)人群。因此，一些學(xué)者探索是否能協(xié)同PD-L1和TMB以提高ICIs療效預(yù)測(cè)的效能。有研究結(jié)果提示，PD-L1表達(dá)聯(lián)合TMB無法提高對(duì)ICIs療效預(yù)測(cè)效能[8,20]。也有研究結(jié)果預(yù)示，二者聯(lián)合應(yīng)用具有更強(qiáng)的ICIs療效預(yù)測(cè)能力，PD-L1和TMB是ICIs獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物，PD-L1表達(dá)及TMB均高的患者臨床療效較好，而二者均低的患者臨床療效較差[22-23]。本研究結(jié)果顯示，ICIs對(duì)PD-L1≥50%且高TMB患者的療效較好，而對(duì)PD-L1<50%且低TMB患者的療效較差，提示PD-L1聯(lián)合TMB可更好有效預(yù)測(cè)ICIs療效。

從現(xiàn)有的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來看，采用ICIs單藥還是ICIs聯(lián)合化療，尚缺乏頭對(duì)頭比較的臨床研究證據(jù)。一項(xiàng)meta研究間接比較PD-L1≥50%患者ICIs單藥或聯(lián)合化療的療效后發(fā)現(xiàn)，ICIs聯(lián)合化療更能為該人群帶來PFS的獲益，但OS未能獲益[24]。將近期更新的KEYNOTE-024和KEYNOTE-189研究結(jié)果間接比較發(fā)現(xiàn)，在PD-L1≥50%的人群中，ICIs聯(lián)合化療與ICIs單藥中位PFS和2年OS率比較無明顯差異，并未明顯提升臨床獲益[25-26]。KEYNOTE-189和KEYNOTE-407研究結(jié)果顯示，PD-L1<50%的NSCLC患者應(yīng)用ICIs聯(lián)合化療明顯優(yōu)于化療，無疑增加了一線應(yīng)用ICIs的適用人群[14,27]。本研究對(duì)PD-L1聯(lián)合TMB的4個(gè)亞組進(jìn)一步分析，結(jié)果提示PD-L1表達(dá)聯(lián)合TMB可指導(dǎo)ICIs用藥方案，當(dāng)PD-L1<50%同時(shí)TMB低時(shí)，ICIs聯(lián)合化療方案或?qū)⒏鼉?yōu)；PD-L1≥50%或者TMB高時(shí)，免疫聯(lián)合化療與ICIs單藥效果接近。

本研究為回顧性研究，提供了實(shí)際臨床應(yīng)用ICIs的真實(shí)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。根據(jù)結(jié)果，提示PD-L1表達(dá)聯(lián)合TMB可更好預(yù)測(cè)ICIs療效，且可指導(dǎo)用藥方案。PD-L1表達(dá)及TMB均低的患者，可考慮使用ICIs聯(lián)合治療；PD-L1高表達(dá)或高TMB的患者，ICIs聯(lián)合化療與ICIs單藥療效接近，考慮到化療毒副作用較大，可考慮ICIs單藥治療。但本研究存在一定的偏倚和局限性：本研究回顧性單中心研究、樣本量較小、部分患者未達(dá)研究觀察終點(diǎn)等。因此，還需加大樣本量，繼續(xù)隨訪ICIs治療患者，并進(jìn)行更大規(guī)模多中心前瞻性研究，追蹤病情轉(zhuǎn)歸，以進(jìn)一步明確研究結(jié)論并驗(yàn)證其臨床價(jià)值。