姚志芳，馮宇哲，王 磊,2*，吳國芳,2，何江波

(1.青海大學 畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016；2.青海大學 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016；3.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

近年來，我國畜牧業(yè)快速發(fā)展，飼糧短缺和供需不平衡問題日益突出。開發(fā)菌體高蛋白飼料資源，優(yōu)化飼糧生產(chǎn)結(jié)構(gòu)，提高飼料利用率已成為發(fā)展畜牧業(yè)的重要途徑[1]。飼料作物的安全性和有效性與國家口糧的安全息息相關(guān)，生產(chǎn)安全優(yōu)質(zhì)的飼料和建立高效的生產(chǎn)體系對畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要的積極影響[2]。飼料質(zhì)量安全體系的建立和飼料質(zhì)量安全水平的提高是飼料發(fā)展的重點任務(wù)之一[3]。因此，研發(fā)安全性生物飼料是保證動物性食品安全的關(guān)鍵。此外，抗生素在動物養(yǎng)殖中的濫用導(dǎo)致的耐藥性、藥物殘留等副作用，給動物和人類健康帶來嚴重危害，而益生菌制劑因其具有促進動物生長[4]、改善消化機能、提高瘤胃菌體蛋白[5]和免疫力等功效在畜牧業(yè)中被廣泛應(yīng)用，有效克服了使用抗生素所產(chǎn)生的一系列問題[6]。青海高海拔地區(qū)牦牛均在自然條件下放牧飼養(yǎng)，未使用抗生素等化學藥物，自然環(huán)境未受到污染，同時西藏青稞在種植過程中未使用化學肥料和農(nóng)藥，使得牦牛瘤胃和青稞酒糟中的有益微生物未受到藥物污染?；诖?，本試驗從青海牦牛瘤胃和西藏青稞酒糟中分離篩選生長性能良好的酵母菌，進一步研究其生理生化特性和益生特性，為后續(xù)酵母菌作為飼料添加劑提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 樣品采自于青海牦牛瘤胃和西藏青稞酒糟。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、1L蒸餾水，自然pH。YPD 固體培養(yǎng)基：在YPD 液體培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離純化與篩選 用瘤胃液采集針抽取5頭成年牦牛瘤胃液各10 mL，混勻后進行梯度稀釋，分別取20 μL涂布YPD固體平板，28 ℃培養(yǎng)48 h。待長出菌落后，挑取具有典型酵母菌菌落特征的形態(tài)、顏色等不同的單菌落進行反復(fù)純化、鏡檢，并保存?zhèn)溆?。取酒糟樣?0 mL梯度稀釋后，分別取20 μL梯度稀釋菌懸液涂布YPD固體平板，28 ℃培養(yǎng)48 h。待長出菌落后，挑取具有典型酵母菌菌落特征的形態(tài)、顏色等不同的單菌落進行反復(fù)純化、鏡檢，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酵母菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學鑒定 菌株細胞形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征、假菌絲形成、擲孢子形成等參照王加啟《反芻動物營養(yǎng)學研究方法》進行[7]。

1.2.2.2 分子生物學鑒定 真菌基因組DNA的提取參照Omega真菌基因組DNA提取試劑盒說明進行。以基因組DNA為模板，PCR擴增酵母菌18S rDNA和26S rDNA基因片段。擴增所用引物序列如下：18S F：5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'；18S R：5'-CCGATCCCTAGTCGGCATAG-3'。NL-1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，NL-4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGA CGG-3'。反應(yīng)條件參照常規(guī)PCR反應(yīng)條件，并根據(jù)引物Tm值和片段長度修改退火溫度和延伸時間。PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將測序結(jié)果進行在線BLAST比對分析，用 DNA Star軟件進行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 酵母菌生理生化特性的測定葡萄糖發(fā)酵、類淀粉形成、尿素分解、肌醇分解、硝酸鉀分解等試驗參照林治宇[8]的方法進行。

1.2.4 酵母菌發(fā)酵特性的測定

1.2.4.1 生長曲線測定 將培養(yǎng)48 h后的酵母菌培養(yǎng)液按3%的接種量接入YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h。以未接種的YPD液體培養(yǎng)基為空白對照，在波長560 nm處測定各時間段酵母菌發(fā)酵液的吸光度(3個重復(fù))。以培養(yǎng)時間為橫坐標，相對應(yīng)的吸光度為縱坐標，采用Graphpad prism8.0軟件繪制生長曲線。

1.2.4.2 產(chǎn)酸曲線測定 將培養(yǎng)48 h后的酵母菌培養(yǎng)液按3%的接種量接入YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h。測定各時間段酵母菌發(fā)酵液的pH(3個重復(fù))。以培養(yǎng)時間為橫坐標，相對應(yīng)的pH為縱坐標，繪制產(chǎn)酸曲線。

1.2.4.3 耐酸測定 將YPD液體培養(yǎng)基的pH分別調(diào)制為1.5，2.0，2.5和3.0，將待測酵母菌按1%接種量接種到已調(diào)制好pH的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測定不同pH下酵母菌的OD560。

1.2.4.4 耐膽鹽測定 在YPD液體培養(yǎng)基中分別加入0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，1%，1.5%和2%的牛膽鹽，將待測酵母菌按照2%接種到已調(diào)制好膽鹽濃度的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測定不同膽鹽濃度下酵母菌的OD560。

1.2.4.5 藥敏性測定 采用藥敏紙片瓊脂擴散法測量每種藥物的抑菌圈直徑(3個重復(fù))。

1.2.4.6 抑菌性測定 采用牛津杯法測定酵母菌對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的抑菌圈直徑(3個重復(fù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離篩選與鑒定

2.1.1 酵母菌的篩選與形態(tài)學鑒定 如表1和圖1所示，9株酵母菌均呈乳白色，JZ4和JZ10圓形微隆，菌落表面干燥，邊緣呈放射狀，有浮膜和菌絲形態(tài)；JZ5和JZ8圓形中央錐形突起，JZ6和JZ9圓形液滴狀，MN24、MN25和MN29菌株圓形，中央禮帽狀突起，該7株酵母菌菌落表面光滑，邊緣整齊，均無浮膜和菌絲形態(tài)。

圖1 酵母菌形態(tài)特征圖注：A 酵母菌菌落形態(tài)；B 酵母菌顯微鏡(400×)形態(tài)；C 酵母菌顯微鏡(400×)菌絲形態(tài)Fig.1 Map of yeast morphological characteristics

2.1.2 酵母菌的分子生物學鑒定 圖2所示，以菌株基因組DNA為模板，酵母菌18S rDNA和26S rDNA基因通用引物擴增，獲得500～600 bp左右的目的條帶，與預(yù)期大小相符；測序結(jié)果經(jīng)Blast比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建(圖3)發(fā)現(xiàn)，JZ4和JZ10菌株與PichiakudriavzeviistrainCBS菌株的相似性達99%，為畢赤酵母菌；JZ5、JZ6、JZ8和JZ9菌株與SaccharomycescerevisiaestrainY4菌株的相似性達99%，為釀酒酵母菌；MN24、MN25和MN29菌株與KluyveromycesmarxianusstrainJCABKM4菌株的相似性達99%，為馬克斯克魯維酵母菌。

圖2 PCR擴增電泳圖注：M 2kb DNA 分子質(zhì)量標準；A 菌株 18S rDNA 基因擴增；B 菌株 26S rDNA 基因擴增Fig.2 PCR amplification electropherogramNote: M 2kb DNA molecular quality standard;A strain 18S rDNA gene amplification;B strain 26S rDNA gene amplification

圖3 分離菌株 18S rDNA 序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strain 18S rDNA sequence

2.2 酵母菌生理生化特性的測定

如表2所示，9株酵母菌均不能同化硝酸鉀，不產(chǎn)生類淀粉物質(zhì)，MN24、MN25和MN29菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸且產(chǎn)氣，其它菌株產(chǎn)酸且不產(chǎn)氣；JZ9和JZ10能分解尿素發(fā)生脲酶反應(yīng)，其它菌株不發(fā)生脲酶反應(yīng)；JZ6和JZ9不同化肌醇，其它菌株均同化肌醇。

2.3 酵母菌發(fā)酵特性的測定

2.3.1 生長曲線測定 由圖4可知，在接種量和培養(yǎng)條件一致時，JZ4、JZ5、JZ6、JZ8和JZ9菌株在4 h時進入對數(shù)生長期，其中JZ5和JZ8菌株在20 h時進入穩(wěn)定期，JZ6和JZ9菌株在24 h時進入穩(wěn)定期，JZ4菌株在36 h時進入穩(wěn)定期。而JZ10、MN24、MN25和MN29菌株在2 h時就已進入對數(shù)生長期，其中MN24和MN25菌株在32 h時進入穩(wěn)定期，JZ10和MN29在44 h時進入穩(wěn)定期。經(jīng)比較可以看出：JZ10、MN24、MN25和MN29菌株起酵時間最短，環(huán)境適應(yīng)性越強，生命力越旺盛；JZ5和JZ8菌株發(fā)酵完成時間最短；JZ5、JZ6、JZ8和JZ9菌株的OD值最大，具有較強的發(fā)酵活性。

圖4 酵母菌生長曲線圖Fig.4 Yeast growth curve

2.3.2 產(chǎn)酸曲線測定 由圖5可知，9株試驗酵母菌生長發(fā)酵72 h后pH≥5.0，其中JZ5、JZ6、JZ8和JZ9菌株在相對較短時間內(nèi)產(chǎn)酸較多，12 h進入穩(wěn)定期，pH降低到5.1左右；JZ4和JZ10產(chǎn)酸速度較慢，產(chǎn)酸較少，但差距不大，28 h進入穩(wěn)定期，pH降低到5.2左右；MN24、MN25和MN29菌株產(chǎn)酸慢且產(chǎn)酸少，24 h進入穩(wěn)定期。說明9株試驗酵母菌產(chǎn)酸最終pH≥5.0，均能在各自產(chǎn)酸環(huán)境中正常生長。

圖5 酵母菌產(chǎn)酸曲線圖Fig.5 Yeast acid production curve

2.3.3 耐酸測定 由圖6可知，在pH為3.0的酸性環(huán)境中，所有菌株生長較pH為6.5時的條件下減慢，但生長OD值變化基本在1左右，基本能正常生長；在pH為2.5的酸性環(huán)境中，JZ5和MN29菌株較其它菌株生長緩慢，JZ10和MN24比其它菌株生長速度較快；在pH為2.0的酸性環(huán)境中，所有菌株生長變化很小，在pH為1.5時基本停滯生長。試驗菌株均可在pH為3.0的低酸環(huán)境中較快生長，用于發(fā)酵飼料時可有效規(guī)避雜菌污染，有益于飼料發(fā)酵。

圖6 酵母菌耐酸曲線圖Fig.6 Yeast acid tolerance curve

2.3.4 耐膽鹽測定 由圖7可知，JZ5和JZ8菌株在膽鹽濃度超過0.2%時OD值變化小于0.3，菌株的生長受到嚴重抑制，膽鹽濃度超過0.6%時基本停滯生長；JZ6和JZ9菌株在膽鹽濃度超過0.6%時OD值變化小于0.5，菌株的生長受到較強的抑制作用，膽鹽濃度超過2.0%時生長緩慢；JZ4和JZ10菌株在膽鹽濃度超過2.0%時OD值變化0.5左右，菌株的生長受到較弱的抑制作用；MN24、MN25和MN29菌株在膽鹽濃度超過1.0%時基本停滯生長。膽鹽對9株酵母菌的生長均有抑制作用。

圖7 酵母菌耐膽鹽曲線圖Fig.7 Yeast bile salt tolerance curve

2.3.5 藥敏性測定 對上述篩選的9株酵母菌進行四環(huán)素、環(huán)丙沙星、妥布霉素、氯霉素、青霉素等12種常用藥物的藥敏性試驗。由表3可知，JZ10菌株對四環(huán)素和青霉素呈中度敏感，對環(huán)丙沙星、妥布霉素、氯霉素和紅霉素呈高度敏感；JZ8菌株對青霉素呈中度敏感，對紅霉素呈高度敏感；其它菌株對12種常用藥物均耐受。

表3 酵母菌藥物敏感性結(jié)果Table 3 Results of yeast drug sensitivity

2.3.6 抑菌性測定 對上述篩選的9株酵母菌進行金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌抑菌性試驗。由表4可以看出，JZ4、JZ5、JZ6、JZ8、JZ9和JZ10菌株均對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有抑制作用，對大腸桿菌無抑制作用；而MN24、MN25和MN29菌株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用，對沙門氏菌無抑制作用。其中，JZ4、JZ9和JZ10菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于20 mm，具有很強的抑菌性能；JZ5、JZ6、JZ8、MN24、MN25和MN29菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在10～20 mm，具有較強的抑菌性能；JZ4、JZ5、JZ6、JZ8、JZ9和JZ10菌株對沙門氏菌的抑菌圈直徑均在10～20 mm，具有較強的抑菌性能；MN24和MN25菌株對大腸桿菌的抑菌圈直徑均在10～20 mm，具有較強的抑菌性能，而MN29菌株對大腸桿菌的抑菌圈直徑大于20 mm，具有很強的抑菌性能。

表4 酵母菌的抑菌結(jié)果Table 4 Antibacterial result of yeast

3 討 論

酵母菌的生長性能和產(chǎn)酸性能是衡量酵母菌的重要衡量指標。酵母菌的生長分為遲緩期、對數(shù)期和穩(wěn)定期[9]。遲緩期為菌株適應(yīng)階段，對數(shù)期為快速發(fā)酵階段，穩(wěn)定期為發(fā)酵完成階段，此時酵母菌數(shù)量達到最高水平[10]。酵母菌的生長特性與菌種密切相關(guān)，快速的起酵速度可縮短生產(chǎn)周期，節(jié)省生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，因此，篩選在最短時間達到快速生長期的菌株在飼料發(fā)酵行業(yè)有重要意義。在菌株生長過程中，延滯期越短，說明菌株環(huán)境適應(yīng)性越強，生命力越旺盛[11]。本試驗結(jié)果表明，畢赤酵母菌JZ10和馬克斯克魯維酵母菌MN24、MN25和MN29菌株起酵時間短，適應(yīng)性強；而釀酒酵母菌JZ5和JZ8發(fā)酵完成時間最短且發(fā)酵活性較強，具有良好的發(fā)酵優(yōu)勢。酵母菌在生長過程中會產(chǎn)酸，降低所生長環(huán)境的pH，監(jiān)控酵母菌在發(fā)酵過程中所處環(huán)境的pH變化，可為其在發(fā)酵飼料行業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)。酵母菌在pH 3.8～6.5的范圍內(nèi)正常生長[12]，試驗結(jié)果表明，這9株試驗酵母菌生長發(fā)酵72 h后pH≥5.0，均能在各自產(chǎn)酸環(huán)境中正常生長。

酵母菌的耐酸和耐膽鹽性能是酵母菌益生性的重要衡量指標。酸性環(huán)境可抑制有害菌生長，篩選出耐酸性強的酵母菌對益生菌制劑的研制有重要意義[13]。益生性菌株在被動物攝入后若要發(fā)揮其益生性作用，就要耐受動物胃液的強酸和小腸內(nèi)的高濃度膽鹽[14]。研究表明，高濃度膽鹽通過疏水作用解離膜蛋白，使膜破裂從而導(dǎo)致益生菌失去生物活性，無法在動物胃腸道發(fā)揮益生作用[15]。動物小腸的膽鹽濃度約在0.03%～0.3%，益生菌在此范圍內(nèi)能正常生長是其在動物胃腸道發(fā)揮益生作用的衡量標準[16]。因此，耐膽鹽也是益生菌篩選中的重要衡量指標。酵母菌耐酸試驗中釀酒酵母菌JZ9和畢赤酵母菌JZ10耐酸性最強，可在低酸環(huán)境正常生長，用于發(fā)酵飼料時可有效規(guī)避雜菌污染，有益于飼料發(fā)酵。耐膽鹽試驗中畢赤酵母菌JZ4和JZ10以及釀酒酵母菌JZ6和JZ9耐受2%濃度的膽鹽，可在動物胃腸道發(fā)揮益生性作用。

益生菌對抗生素的敏感性和對病原菌的抑制性是益生菌體外安全實驗的重要評價指標。動物攝入有耐藥性的益生菌后可能會產(chǎn)生對抗生素的耐藥性，動物機體內(nèi)的其他菌株也可能會受到所飼喂益生菌耐藥性的有害誘導(dǎo)，導(dǎo)致治療難度加大[17]。目前對益生性酵母菌的篩選指標主要有蛋白含量、發(fā)酵速度、活菌數(shù)量等，從酵母菌抑菌性進行篩選的文獻較少[18]。有研究發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵乳中篩出的酵母菌對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有抑菌作用[19]，也有研究發(fā)現(xiàn)從馬奶酒中篩出的酵母菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特氏菌有抑菌作用[20]。因此，無耐藥性和強抑菌性是篩選益生菌的重要衡量指標。該試驗中，畢赤酵母菌JZ10有廣泛的藥物敏感性且對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有強抑制作用，可作為抑制病原菌的安全性優(yōu)勢菌株應(yīng)用于畜牧業(yè)。

4 結(jié) 論

本試驗從從青海牦牛瘤胃中篩選到馬克斯克魯維酵母菌3株，從西藏青稞酒糟中篩選到釀酒酵母菌4株，畢赤酵母菌2株。其中，畢赤酵母菌JZ10相比于其它菌株起酵時間短，環(huán)境適應(yīng)性強，有廣泛的藥物敏感性且對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有強抑制作用，具有良好的生長特性和益生特性，可用于益生菌制劑的制備。