趙浩名，孫志陽，路宏朝，王 令，王珊珊，張 濤

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

羽色是雞外觀差異最大的性狀之一，也是區(qū)分不同雞品種的主要特征，不同地方雞品種都有其獨特的羽色，羽色對人民群眾的消費觀念有一定影響。略陽烏雞產(chǎn)于陜西省漢中市略陽縣黑河流域，為陜西優(yōu)良地方品種，被列入《陜西省畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》，是陜西省唯一的家禽保護(hù)品種，2009年被列為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品[1]。略陽烏雞具有烏皮、烏喙、烏腿、烏趾、烏舌、烏冠“六端烏”典型特征，肉質(zhì)優(yōu)良，羽色多樣，有黑、麻、白三種類型[2]。目前，略陽烏雞的選育以黑羽性狀為主，青腳麻雞肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)價值高，爪為青色，羽毛為棕褐色，適應(yīng)性強(qiáng)、生長快、是目前廣泛養(yǎng)殖的肉雞品種[3]。絲羽烏雞又名泰和烏雞，羽毛為白色絲狀，是馳名中外的烏雞品種[4]。在家禽遺傳育種實踐中，羽色一直是一個主要的選育指標(biāo)，其與消費者的喜好密切相關(guān)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，但禽類羽色的生物學(xué)機(jī)制比較復(fù)雜，許多學(xué)者都對禽類羽色形成的遺傳機(jī)制進(jìn)行了研究。目前關(guān)于禽類羽色和哺乳動物毛色研究的報道都與黑素皮質(zhì)素受體1(MC1R)基因的多態(tài)性和表達(dá)量有關(guān)[5]。

MC1R屬于黑素皮質(zhì)素受體(MCR)家族，是GTP結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)中最小的成員[6]，在色素沉積中起到關(guān)鍵作用[7]，被確定為黑色素合成和分布的主要決定因素。MC1R由黑色素擴(kuò)散位點(E)編碼，E位點參與控制黑色素的合成和分布，影響皮膚和毛發(fā)的顏色[8]。MC1R與α促黑色素細(xì)胞激素(α-MSH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)結(jié)合，促進(jìn)cAMP和酪氨酸酶的表達(dá)，使黑色素含量增加[9]。MC1R也參與多種病理生理過程，是黑色素瘤易感基因，其變異會導(dǎo)致細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子2A(CDKN2A)突變，從而增加患黑色素瘤的風(fēng)險[10]。MC1R作為控制毛色和羽色關(guān)鍵候選基因，其在哺乳動物中已做了較為系統(tǒng)的研究，但是禽類的羽色性狀比哺乳動物更為復(fù)雜，不同品種及同一品種不同群體之間也存在較大差異[11]。因此，在不同家禽品種或者同一品種不同羽色群體之間研究MC1R基因多態(tài)性與羽色中的相關(guān)性研究，鑒定出不同類型的SNP對于家禽羽色性狀遺傳機(jī)制解析和遺傳育種都具有重要意義。

本研究以略陽烏雞(黑羽)、青腳麻雞(麻羽)和絲羽烏雞(白羽)為試驗材料，比對分析不同品種MC1R基因編碼區(qū)DNA序列和氨基酸序列，進(jìn)行SNP和羽色相關(guān)性分析，以期獲得與羽色密切相關(guān)的SNP位點，進(jìn)一步豐富MC1R基因在禽類羽色研究中的分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

略陽黑羽烏雞30只購自略陽縣陜西同輝農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，青腳麻雞和絲羽烏雞各20只，購自陜西省城固縣龍西養(yǎng)殖孵化場。

1.2 DNA提取

取雞肝臟組織，基因組DNA提取按照文獻(xiàn)[12]的操作流程進(jìn)行，溶于超純水，-80 ℃長期保存。

1.3 引物序列

根據(jù)NCBI上的紅原雞MC1R基因序列(GenBank登錄號為AB201630)，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計PCR引物，引物序列為MC1R-F，5'-GGGCTTTGTAGGTGCTGCAGTTG-3'和MC1R-R，5'-CATCCATCCTCCTGTCTGTGCC-3'，由通用生物系統(tǒng)安徽有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增與檢測

PCR擴(kuò)增體系：上、下游引物各2 μL，Mix 25 μL，模板DNA 2 μL，加入dd H2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠成像儀上拍照。

1.5 測序與比對

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送通用生物系統(tǒng)安徽有限公司測序，使用SECentral 7.01軟件進(jìn)行序列拼接。以紅原雞MC1R基因序列為參照，通過DNAMAN 5.0軟件對略陽黑羽烏雞、青腳麻雞、絲羽烏雞的MC1R基因序列進(jìn)行比對分析。

1.6 蛋白理化參數(shù)分析

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對MC1R蛋白理化參數(shù)進(jìn)行分析。

1.7 二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對MC1R蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.8 三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

使用Swiss Model在線網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/)對MC1R蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.9 統(tǒng)計分析

本研究根據(jù)SNPs位點定義不同基因型，在計算群體不同位點基因型頻率和等位基因頻率后，通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行了MC1R基因SNP位點與羽色性狀的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC1R基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖1可以看出，每一個樣品均擴(kuò)增出大小位于1 000 bp以上的單一條帶，PCR產(chǎn)物與目的片段預(yù)期大小(1 026 bp)一致，說明成功擴(kuò)增出3個雞種MC1R基因，且無非特異性擴(kuò)增，能夠直接用于后續(xù)測序分析。

圖1 MC1R基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖M.DL-2000；1-10.PCR產(chǎn)物Fig.1 Gel electrophoresis map of PCR products of MC1R geneM.DL-2000；1-10.PCR products

2.2 三個雞種MC1R基因測序與比對

以NCBI公布的紅原雞MC1R基因編碼區(qū)為參照，通過SECentral 7.01軟件對MC1R基因編碼區(qū)測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，發(fā)現(xiàn)3個雞種該基因CDS區(qū)長度均為945 bp。采用DNAMAN 5.0軟件對3個雞種MC1R基因編碼區(qū)進(jìn)行序列比對(圖2)，發(fā)現(xiàn)3個雞種與紅原雞序列同源性均在99 %以上。3個雞種群體中共檢測到8個MC1R基因SNPs，分別為69(C/T)、212(T/C)、274(G/A)、398(T/C)、636(G/A)、637(T/C)、644(A/C)和834(C/T)，各位點堿基變異如圖3所示。

圖2 3個雞種群與紅原雞MC1R基因序列比較Fig.2 Comparison of MC1R gene sequences between three chicken populations and Hongyuan chicken breed

圖3 MC1R基因SNPs位點測序結(jié)果Fig.3 Results of SNPs site sequencing of MC1R gene

2.3 不同類型雞MC1R氨基酸序列分析

將3個雞種不同突變類型MC1R的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)本試驗檢測到的8個SNPs位點中有4個導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生變化，分別為212(T/C)、398(T/C)、637(T/C)和644(A/C)，各位點引起的氨基酸序列變異見表1。根據(jù)氨基酸序列的差異，本研究以紅原雞MC1R氨基酸序列為參考，將其定位為I型，在略陽黑羽烏雞、青腳麻雞和絲羽烏雞發(fā)現(xiàn)了II型、III型、IV型和V型4種MC1R類型，各類型氨基酸序列比對結(jié)果如圖4所示，且MC1R蛋白II型、III型、IV型、V型與I型的氨基酸序列相似度在97%～99%。以MC1R蛋白I型為參照，II型與I型相比有2處突變，分別為71(M/T)和213(C/R)；III型與I型相比有1處突變，為71(M/T)；IV型與I型相比有2處突變，分別為71(M/T)和215(H/P)；V型與I型相比有2處突變，分別為133(L/P)和213(C/R)。對不同類型MC1R蛋白類型進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)略陽黑羽烏雞存在兩種MC1R蛋白類型，而青腳麻雞和絲羽烏雞只有一種MC1R蛋白類型，見表2。

圖4 不同類型MC1R蛋白氨基酸序列比較Fig.4 Comparison of amino acid sequences of different types of MC1R proteins

表1 MC1R基因SNPs與對應(yīng)的氨基酸變化情況Table 1 Changes of MC1R gene SNPs and corresponding amino acids

2.4 不同類型MC1R蛋白的理化性質(zhì)分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析

由表3知，不同類型的MC1R蛋白理化性質(zhì)存在一定差異，其中IV型不穩(wěn)定系數(shù)最高，II型不穩(wěn)定系數(shù)最低，I型、II型、III型和IV型脂肪系數(shù)相同，均高于V型，V型總平均疏水性最弱，I型最高。

類型Types71133213215備注NoteI型TypeIMetLeuCysHis紅原雞(100%)II型TypeIIThrLeuCysHis略陽烏雞(50%)III型TypeIIIThrLeuArgHis略陽烏雞(50%)IV型TypeIVThrLeuCysPro青腳麻雞(100%)V型TypeVMetProArgHis絲羽烏雞(100%)

表3 不同類型MC1R蛋白的理化性質(zhì)分析Table 3 Analysis of physicochemical properties of different types of MC1R proteins

由圖5可見，MC1R有7個高疏水性域、5個高親水性域、7個跨膜結(jié)構(gòu)與幾個卷曲螺旋區(qū)域。分析發(fā)現(xiàn)I型α-螺旋占51.27%、β-折疊占2.55%、無規(guī)則卷曲占27.71%；II型α-螺旋占50.32 %、β-折疊占2.55%、無規(guī)則卷曲占29.94%；III型α-螺旋占52.55%、β-折疊占2.87%、無規(guī)則卷曲占26.43%；IV型α-螺旋占54.14 %、β-折疊占3.50%、無規(guī)則卷曲占25.16%；V型α-螺旋占56.05%、β-折疊占1.91%、無規(guī)則卷曲占26.43%。

圖5 MC1R蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果注：藍(lán)色，α-螺旋；紅色，延伸鏈；Fig.5 Prediction of secondary structure of MC1R proteinNote:blue,α-helix;red,extended chain

使用Swiss Model軟件對MC1R蛋白序列進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，模型覆蓋了87%～92%的氨基酸，其中α-螺旋構(gòu)成7個跨膜區(qū)(圖6)。從三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)I型、II型、III型、IV型和V型三維結(jié)構(gòu)基本一致，不同類型間氨基酸序列的變異雖然導(dǎo)致部分區(qū)域發(fā)生較小變化，但沒有導(dǎo)致MC1R蛋白結(jié)構(gòu)的整體性改變，說明該蛋白結(jié)構(gòu)保守，具有重要的生物學(xué)功能，其中一些變異位點可能影響其部分生物學(xué)活性，但不影響其基本生理功能。

圖6 MC1R蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果Fig.6 Prediction of tertiary structure of MC1R protein

2.5 不同雞種SNPs位點分布頻率及羽色性狀的關(guān)聯(lián)分析

對造成氨基酸序列改變的4個SNPs在3個雞種群體的分布頻率和羽色相關(guān)性進(jìn)行分析(表4)，發(fā)現(xiàn)212(T/C)、398(T/C)、637(T/C)和644(A/C)位點的基因頻率在3個群體之間存在極顯著差異(P<0.001)。其中，在212(C/T)位點和398(T/C)位點，略陽黑羽烏雞和青腳麻雞全部為C/C和T/T型；637(T/C)位點，略陽黑羽烏雞存在3種基因型，青腳麻雞只有T/T型，絲羽烏雞只有C/C型；644(A/C)位點，略陽黑羽烏雞和絲羽烏雞全部為A/A型，青腳麻雞全部為C/C型。通過基因型和羽色相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)各SNPs均與羽色性狀存在極顯著相關(guān)性。

表4 MC1R基因SNPs位點分布頻率與羽色關(guān)聯(lián)性分析Table 4 Analysis of the relationship between SNPs locus distribution frequency of MC1R gene and feather color

3 討 論

MC1R基因與黑色素形成、黑色素瘤及動物體內(nèi)黑色素的沉積、遷移與分布密切相關(guān)[13]。本研究選擇略陽黑羽烏雞、青腳麻羽烏雞和白色絲羽烏雞3個羽色特征鮮明的品種為對象，研究MC1R基因在3個雞種中的DNA序列變異，篩選與羽色性狀密切相關(guān)的SNPs，以期獲得有效的選育標(biāo)記。

MC1R是黑素皮質(zhì)素受體家族成員，其蛋白結(jié)構(gòu)可以分為N末端和C末端，含有7個由α螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域[14]。MC1R參與多種生理病理過程，在色素沉積中起關(guān)鍵作用，控制黑色素的合成和分布，影響動物皮膚和毛發(fā)的顏色[7]。MC1R基因突變可能會改變其活性，哺乳動物MC1R的基因型多態(tài)性與黑色素沉積差異有關(guān)[15]。Hirokazu等[16]對日本褐牛研究，發(fā)現(xiàn)MC1R基因c.871G>A位點突變導(dǎo)致日本褐牛毛色變異。陳多珍等[17]在狄高肉雞MC1R基因編碼區(qū)檢測到8個SNP位點。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，云南飄雞MC1R基因的C69T、T212C和A274G位點與瓦灰色羽毛顯著相關(guān)。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，非同義SNP 212T>C導(dǎo)致第71位氨基酸由蛋氨酸替換為蘇氨酸，影響了雞MC1R蛋白的生物學(xué)功能。在哺乳動物和鳥類細(xì)胞中，過表達(dá)的MC1R會導(dǎo)致黑色素合成增加，而低表達(dá)的MC1R則會導(dǎo)致黑色素合成不足[20]。目前認(rèn)為MC1R通過促進(jìn)cAMP表達(dá)，激活小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)使黑色素沉積[21]。

本研究在3個雞種MC1R基因編碼區(qū)檢測到8個SNPs位點，4個SNPs引起氨基酸變化，分別是212(T/C)、398(T/C)、637(T/C)和644(A/C)，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)這4個SNPs位點均與雞羽色極顯著關(guān)聯(lián)(P<0.001)。在略陽黑羽烏雞和青腳麻雞中發(fā)現(xiàn)的212(T/C)突變，該突變位點在赤水烏骨雞和興義白雞中也存在[22]。絲羽烏雞中發(fā)現(xiàn)的398(T/C)位點突變在廣元灰雞則是398(T/A)突變[23]。略陽黑羽烏雞和絲羽烏雞的637(T/C)在貴州黃快、慢羽雞、興義白雞和羅曼蛋雞中也有發(fā)現(xiàn)[24]。青腳麻雞的644(A/C)突變在興義白雞中也有發(fā)現(xiàn)[24]。基于SNPs導(dǎo)致的氨基酸序列變異，本研究以紅原雞MC1R序列為參考，定義了II型、III型、IV型與V型4種MC1R蛋白類型，并進(jìn)行了蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和機(jī)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)不同類型的MC1R的穩(wěn)定性、疏水性和脂肪系數(shù)存在一定差異，二級結(jié)構(gòu)略有變化，但是蛋白質(zhì)整體三級結(jié)構(gòu)影響不大，只是部分區(qū)域發(fā)生較小改變，說明該蛋白具保守的生物學(xué)功能，一些位點的變異可能影響部分生物學(xué)功能，但對其基本生理功能沒有改變。

本研究通過對羽色特征差異明顯的3個雞種MC1R基因序列分析，共檢測到8個SNPs，其中4個SNPs位點引起氨基酸序列變異，對MC1R蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定改變，可能影響了蛋白質(zhì)的功能。各變異位點與羽色相關(guān)分析顯示呈現(xiàn)出顯著性，該研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了對MC1R在禽類黑色素沉積和分布研究中的數(shù)據(jù)，同時為雞品種遺傳資源評價、保護(hù)和選育提供了理論支撐，建議將其作為雞羽色選育的參考分子標(biāo)記。