王世杰，張薇依，王建芳，毛 潮，隋 潔，賈存靈

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

在哺乳動物中，有節(jié)律的生理和行為功能的組織受控于位于下丘腦視交叉上核(SCN)?？刂乒?jié)律的組織不限于SCN，而在大多數(shù)外周組織中也有分子鐘表達(dá)和作用[1]。哺乳動物體內(nèi)大約5%到10%的轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)節(jié)律性[2]，蛋白質(zhì)組分析顯示，大約有20%的蛋白呈周期性表達(dá)，其中一些具有相應(yīng)的mRNA表達(dá)[3]。此外，呈周期性表達(dá)的mRNA比前體RNA更豐富[4]，這些差異表示轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾機制在調(diào)節(jié)生物節(jié)律中的重要性。

microRNA(miRNA)是一類小的單鏈RNA分子，長度約為18～25nt，由基因組非編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄[5]。通過與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'untranslational region，3'UTR)內(nèi)的互補位點結(jié)合來使mRNA翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄降解來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá)[6]。從胚胎發(fā)育開始，到細(xì)胞凋亡，乃至腫瘤生長，miRNA在一系列生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，miRNA與生物節(jié)律存在聯(lián)系，miRNA可參與到中樞和外周生物節(jié)律的調(diào)控中[7]，如腦特異性的miR-132參與生物節(jié)律的光調(diào)控，可抑制光誘導(dǎo)的時相延遲，以達(dá)到節(jié)律同步作用[8]。在大鼠的研究中，鐘基因Bmal1與miR-103的表達(dá)相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄后水平對晝夜節(jié)律進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。在小鼠上利用基因芯片技術(shù)，研究以12L：12D的光照下肝臟上miRNA和mRNA之間的表達(dá)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)205個miRNA靶向Clock、Bmal1、per1-3等鐘基因，說明miRNA在生物節(jié)律調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10]。

在生物鐘基因中，Rev-erbβ(Nr1d2)基因是編碼核激素受體家族的一員，其編碼的蛋白能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與晝夜節(jié)律變化，及碳水化合物和脂代謝過程[11]。Nr1d2基因在絨山羊毛囊的周期生長中存在表達(dá)差異[12]。據(jù)報道，安哥拉兔的miR-218能夠激活Wnt信號通路，在皮膚和毛囊發(fā)育過程中起動態(tài)調(diào)節(jié)作用[13]；miR-128通過靶向TGF-1的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Smad2來調(diào)控人的毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞的分化[14]。因此，本研究通過對miR-218和miR-128與Nr1d2基因靶向關(guān)系進(jìn)行初步的探究，以期為研究Nr1d2基因可能參與的毛囊發(fā)育等生物節(jié)律現(xiàn)象機制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 miRNA的預(yù)測和篩選

根據(jù)miRNA與基因存在相互作用調(diào)控的關(guān)系，利用Target Scan網(wǎng)站對目標(biāo)Nr1d2基因進(jìn)行miRNA預(yù)測[15]。

1.2 雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建

用Premier 5軟件設(shè)計包含結(jié)合位點片段的引物，并插入限制性XhoI或NotI酶切位點(引物見表1)，以全基因組DNA為模板，擴增出包含靶點的目的片段，利用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit(Omega)純化回收目的片段。將回收純化的目的片段和骨架載體psiCHECHETM-2，用限制性內(nèi)切酶Xho1和Not1切割，連接回收純化后的切割產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，用AMP培養(yǎng)基篩選陽性菌落，挑取單克隆，搖菌，將菌液送去測序；測序結(jié)果比對正確的菌液進(jìn)行擴繁，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒Endo-Free Plasmid Midi Kit(Omega)提取質(zhì)粒，以備后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗使用。

表1 PCR擴增引物Table 1 PCR primers

1.3 突變型雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建

根據(jù)點突變原理(圖1A)，用Premier 5軟件設(shè)計結(jié)合位點突變的引物(圖1B)，以上述連接成功的質(zhì)粒為模板，擴增出包含突變靶點的質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物用DpnI酶處理，切除模板質(zhì)粒。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DMT感受態(tài)(TransGen Biotech)，用AMP培養(yǎng)基篩選陽性菌落，挑取單克隆，搖菌，測序；測序結(jié)果正確的菌液提取質(zhì)粒，以備后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗使用。

圖1 突變型載體的構(gòu)建A.點突變原理(Trans Gen Biotech)；B.突變引物Fig.1 Construction of mutant vectorsA.Point mutation principle(TransGen Biotech)；B.Mutation primer

1.4 細(xì)胞分離培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

1.5 雙熒光素酶活性的檢測

為了驗證chi-miR-128-3p和chi-miR-218與Nr1d2基因的靶向關(guān)系，將上述構(gòu)建好的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，通過mimics+WT，mimics NC+WT，mimics+MUT,mimics NC+MUT的方式進(jìn)行共轉(zhuǎn)染在24孔板中，轉(zhuǎn)染后24～48 h檢測檢測細(xì)胞內(nèi)相對RLU值(Relative lucifcrase activity)。

1.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS 18.0(IBM)軟件進(jìn)行t檢驗。每組結(jié)果數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示?！?”P<0.05為差異顯著，“**”P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nr1d2基因的miRNA的預(yù)測和篩選結(jié)果

Nr1d2基因的3'UTR區(qū)域與chi-miR-128-3p和chi-miR-218的結(jié)合位置如圖2A所示，其結(jié)合種子序列均為7 bp，chi-miR-128-3p與Nr1d2基因 3'UTR的結(jié)合位點為mRNA的2678-2685 bp處，chi-miR-218的結(jié)合位點為4114-4121 bp處。使用在線軟件BiBiServ[16]中的RNA hybrid功能對Nr1d2 mRNA 3'UTR與chi-miR-128-3p和chi-miR-218結(jié)合位點和結(jié)合自由能進(jìn)行預(yù)測，并分析其二級結(jié)構(gòu)(圖2B)。Nr1d2 mRNA的3'UTR與chi-miR-128-3p結(jié)合的自由能為-25 kcal/mol，Nr1d2 mRNA的3'UTR與chi-miR-218結(jié)合的自由能為-24 kcal/mol，相對而言，Nr1d2 mRNA 3'UTR與chi-miR-218可能更容易結(jié)合。

圖2 生物信息學(xué)分析A.Nr1d2 3'UTR結(jié)合區(qū)域；B.chi-miR-128-3p和chi-miR-218的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Bioinformatics analysisA.Nr1d2 3'UTR binding region；B.Secondary structures of chi-miR-128-3p and chi-miR-218

2.2 構(gòu)建出的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體

PCR擴增得到Nr1d2 mRNA 3'UTR兩個片段克隆(圖3A)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小如圖3C所示，與目標(biāo)序列大小相符，之后利用XhoI和NotI內(nèi)切酶對psiCHECKTM-2和目的片段雙酶切并連接，構(gòu)建野生型雙熒光素酶報告載體psiCHECKTM-2-Nr1d2-3'UTR-WT，并對chi-miR-128-3p和chi-miR-218結(jié)合位點進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型雙熒光素酶報告載體psiCHECKTM-2-Nr1d2-3'UTR-MUT，經(jīng)公司測序顯示，結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致(圖3D)，表明成功構(gòu)建了野生型和突變型雙熒光素酶報告載體。

圖3 雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建A.包含靶點的目的片段(Maker左側(cè)為包含chi-miR-128-3p靶點的3'UTR；Maker右側(cè)為包含chi-miR-218靶點的3'UTR)；B.psiCHECKTM-2載體；C.凝膠電泳圖；D.野生型和突變型載體部分測序結(jié)果Fig.3 Construction of a dual luciferase reporter vectorA.contains the target fragment of interest (The left side of the Maker was the 3'UTR containing chi-miR-128-3p target;the right side of the Maker was the 3'UTR containing chi-miR-218 target)；B.psiCHECKTM-2 vector；C.Gel electrophoresis；D.partial sequencing results of wild-type and mutant vectors

2.3 雙熒光素酶活性分析

構(gòu)建成功的psiCHECKTM-2-Nr1d2-3'UTR-WT、psiCHECKTM-2-Nr1d2-3'UTR-MUT與chi-miR-128-3p mimics、chi-miR-218 mimics、mimics NC分別共轉(zhuǎn)染到293 A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24～48 h后檢測細(xì)胞內(nèi)RLU值。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染chi-miR-128-3p mimics對野生型和突變型載體的熒光素酶活性無顯著影響(圖4A)。而轉(zhuǎn)染chi-miR-218 mimics能使野生型熒光素酶活性極顯著下降(P<0.01)，而對突變型熒光素酶活性無影響(圖4B)，試驗結(jié)果表明chi-miR-128-3p和Nr1d2的關(guān)系有待探究，但可以證明chi-miR-218通過靶向Nr1d2-3'UTR區(qū)域，抑制了雙熒光素酶的活性，初步確定Nr1d2是chi-miR-218的靶基因。

圖4 雙熒光素酶活性檢測A.chi-miR-128-3p雙熒光素酶活性檢測；B.chi-miR-218雙熒光素酶活性檢測；**表示P<0.01Fig.4 Dual luciferase assaysA.Dual luciferase assays of chi-miR-128-3p；B.Dual luciferase assays of chi-miR-218；** means P<0.01

3 討 論

生物節(jié)律驅(qū)使許多細(xì)胞功能呈現(xiàn)時間變化，包括基因表達(dá)、代謝以及細(xì)胞周期。生物鐘是由一組特定的轉(zhuǎn)錄因子組成的，這些轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成了生物鐘的分子結(jié)構(gòu)。許多環(huán)境因素如食物、光照和溫度等會影響生物節(jié)律及相關(guān)生物鐘基因的表達(dá)變化[17]，這些變化常常受表觀遺傳的調(diào)控。miRNA是其中一種表觀遺傳修飾，它廣泛存在于動物中，在生物體內(nèi)的功能作用和調(diào)控機制已有大量研究報道[18]，其參與生物節(jié)律的調(diào)控日益受到研究者的重視。研究發(fā)現(xiàn)，Nr1d2在調(diào)節(jié)飲食行為和能量消耗方面的起到關(guān)鍵作用，Nr1d2基因敲除后，小鼠表現(xiàn)出飲食依賴性的代謝失調(diào)[19]；Nr1d2也參與毛囊的發(fā)育[12]。但有關(guān)該基因可能與哪些miRNA有關(guān)鮮有報道。因此本研究用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)確定miRNA與預(yù)測靶基因調(diào)控關(guān)系。

通過用Target Scan網(wǎng)站進(jìn)行初步篩選，最終確定了chi-miR-128-3p和chi-miR-218，并成功構(gòu)建了野生型以及突變型雙熒光素酶報告載體。將chi-miR-128-3p和chi-miR-218的mimics以及mimics NC分別與構(gòu)建的雙熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞系中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示chi-miR-128-3p對細(xì)胞RLU值無顯著影響，說明chi-miR-128-3p與Nr1d2不存在靶向關(guān)系。chi-miR-218對細(xì)胞RLU值有顯著的影響(P<0.01)，因此，初步判定chi-miR-218與Nr1d2存在靶向關(guān)系。研究顯示，miR-218通過靶向Wnt抑制劑，從而促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[20]，從而影響細(xì)胞增殖[21]。研究miRNA在生物節(jié)律中的具體靶點和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，將有助于更好地理解生物節(jié)律的調(diào)控機制。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)確定了miR-218靶向Nr1d2基因的3'UTR區(qū)域。