丁高峰，郭雷鳴，柯少瑞，陸寓非

0 引言

多形性腺瘤（pleomorphic adenoma,PA）是腮腺中最常見的腫瘤，也被稱為混合瘤，占所有腮腺腫瘤的60%～70%，世界衛(wèi)生組織根據(jù)PA的組織病理學及生物學特性，將其界定為臨界瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計，每10萬人就有1.4～2.3人發(fā)生該病，且PA發(fā)病率呈逐年遞增趨勢[2]。雖然PA生長比較緩慢，但其術(shù)后復發(fā)率可達到20%～45%，且多次復發(fā)可致惡變[3]。PA最常見的類型是癌在多形性腺瘤（carcinoma in pleomorphic adenoma,CA-EX-PA），約占涎腺惡性腫瘤的10%～20%，且90%以上都是由PA惡變所致，可危及生命，盡早發(fā)現(xiàn)兩者的生物學行為、治療方法及判斷預后一直是醫(yī)學界研究的熱點[2]。

線粒體在細胞生存和死亡中發(fā)揮重要作用。為維持細胞的正常活動狀態(tài),細胞要選擇性地清除受損傷或不需要的線粒體,這一過程被稱為線粒體自噬（mitochondrial autophagy或mitophagy）[4]。線粒體自噬與腫瘤的關系成為醫(yī)學研究的熱點，作為誘導線粒體自噬的關鍵基因，PINK1/Parkin通路是主要分子調(diào)控機制之一，也是線粒體自噬的經(jīng)典途徑之一[5]。PINK1和Parkin具有協(xié)同作用，當它們?nèi)魏我环奖磉_水平異?；蚬δ苁艿揭种茣r，清除受損線粒體的自噬能力會明顯下降，使細胞正常生理功能進一步受到損害[6-7]。

目前，線粒體自噬活性的改變與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,且線粒體自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段所發(fā)揮的作用也不同。腫瘤發(fā)生早期，線粒體自噬維持細胞正常的新陳代謝，抑制腫瘤的發(fā)生；腫瘤發(fā)生后期，線粒體自噬的發(fā)生則會提高細胞的耐受，促進腫瘤的發(fā)展[8]。在卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)線粒體自噬基因出現(xiàn)等位缺失現(xiàn)象，但其在腮腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展階段，線粒體活性是否發(fā)生變化目前尚不清楚[9]。因此，本研究擬通過免疫組織化學的方法檢測正常腮腺組織、腮腺多形性腺瘤及癌在多形性腺瘤組織中PINK1和Parkin的蛋白表達差異，探討線粒體自噬在多形性腺瘤及其惡變中的作用，為進一步了解多形性腺瘤及其惡變提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2016年4月—2018年4月間鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院確診的PA組織32例、CA-EX-PA組織42例。所有組織標本均未行術(shù)前放療和化療，并收集24例正常腮腺組織作為對照組。4%甲醛溶液常規(guī)固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，HE染色。所有患者事前均已簽署《生物標本二次利用知情同意書》。

1.2 主要試劑

兔抗人PINK1和Parkin單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學檢測試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液、蘇木素染色試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其余試劑購于中國醫(yī)藥上海化學試劑公司。

1.3 免疫組織化學檢測PINK1和Parkin的蛋白表達差異

10%福爾馬林固定標本，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟，依次經(jīng)100%、95%、80%、70%及50%梯度濃度酒精水化，每個濃度5 min，PBS緩沖液沖洗，熱抗原修復，滴加5%的山羊血清，室溫下放置20～30 min，封閉非特異性抗原，滴加一抗PINK1（1:2 000）、Parkin（1:2 000）并置于4℃的冰箱過夜，取出切片，37℃孵育箱復溫30 min后，PBS沖洗，滴加二抗37℃孵育30 min后PBS沖洗，加辣根過氧化物酶工作液反應15 min，DAB顯色。蘇木素對比染色，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，并拍照觀察。

1.4 免疫組織化學結(jié)果評價標準

當細胞質(zhì)染成棕褐色、棕黃色、黃色或淡黃色時，認為PINK1和Parkin兩種蛋白陽性表達。利用二級計分法對兩種蛋白的表達進行評定：隨機選取每個切片10個200×的顯微鏡視野，通過陽性細胞百分率和染色深度進行評分。陽性率評分：陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)＜5%計為0分，5%～20%計為1分，≥20%～50%計為2分，≥50%計為3分。染色深度評分：無染色計為0分，淡黃色計為1分，黃色/棕黃色計為2分，褐色/棕褐色計為3分。兩項評分相乘即為總評分：0～2分計為陰性（-），3～4分計為弱陽性（+），5～6分計為中強陽性（++），6分以上計為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)軟件分析陽性細胞的吸光度（IOD），采用χ2檢驗和Spearman等級分析進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果采用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0進行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PINK1和Parkin蛋白在三種組織中的表達

正常腮腺組織、PA組織和CA-EX-PA組織中PINK1蛋白陽性表達率依次為100%、91%和67%，PA和CA-EX-PA組織中PINK1的表達率顯著低于正常組織（均P＜0.05）。Parkin蛋白在三種組織中陽性表達率依次為100%、88%和52%，PA和CA-EXPA組織中Parkin的表達率同樣顯著低于正常組織（均P＜0.05），見表1、圖1。

表1 PINK1和Parkin在不同組織中的表達 (n)Table 1 Expression of PINK1 and Parkin in different tissues (n)

圖1 PINK1和Parkin在正常腮腺、PA及CA-EA-PA組織中的表達 (SP ×200)Figure 1 Expression of PINK1 and Parkin in normal parotid,PA and CA-EX-PA tissues detected by immunohistochemistry (SP ×200)

2.2 CA-EX-PA組織中PINK1和Parkin蛋白表達的相關性

Spearman等級分析結(jié)果顯示PINK1和Parkin蛋白在CA-EX-PA組織中的表達具有正相關性（r=0.877,P＜0.05），見表2。

表2 PINK1和Parkin在CA-EX-PA組織中表達的相關性Table 2 Correlation between PINK1 and Parkin expression in CA-EX-PA tissues

2.3 PINK1和Parkin蛋白在CA-EX-PA組織中表達與臨床病理特征的關系

C A-E X-PA 患者的年齡、性別和腫瘤直徑與PINK1和Parkin蛋白表達不具有相關性（P＞0.05），CA-EX-PA患者的腫瘤侵襲性、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PINK1和Parkin蛋白的表達顯著相關（P＜0.05），見表3。

表3 CA-EX-PA患者中PINK1和Parkin表達與臨床病理因素的關系Table 3 Correlation of PINK1 and Parkin expression with clinicopathological of CA-EX-PA patients

3 討論

線粒體自噬能夠選擇性清除多余或受損線粒體，在維持細胞內(nèi)線粒體數(shù)量以及線粒體的正常功能方面發(fā)揮重要的作用[10]。正常情況下，自噬體的生成和降解之間保持動態(tài)平衡，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；病理狀態(tài)下，自噬體生成過多或清除過少，會引起細胞內(nèi)受損線粒體大量堆積，導致細胞線粒體自噬異常，最終細胞功能產(chǎn)生紊亂甚至凋亡[11]。PINK1和Parkin是誘導線粒體自噬的重要因子，兩者的表達缺失能夠引起細胞線粒體自噬活性降低，可能導致腫瘤的發(fā)生[12-13]。研究顯示在人類多種腫瘤中均有線粒體自噬活性改變的現(xiàn)象。例如，利用致癌物質(zhì)誘導鼠的胰腺細胞后，線粒體自噬在癌變前期活性升高，但是當完成癌變以后，線粒體自噬活性能力反而減弱，提示線粒體自噬活性的降低可能促進一些腫瘤的惡化。腮腺腫瘤的發(fā)生是否與線粒體自噬相關因子的表達發(fā)生變化相關，是否參與了腮腺腫瘤的病理進程，目前相關方面報道甚少。

PINK1和Parkin蛋白可能具有抑制腫瘤功能，在乳腺癌、肺癌、直腸癌、卵巢癌等腫瘤中均表現(xiàn)為缺失表達，兩者的表達水平顯著低于正常組織[14]。Jeong等研究證實在小鼠胰腺癌癌變早期線粒體自噬水平明顯升高，而晚期則顯著降低[15]。另有實驗研究顯示，在敲除PINK1等位基因的小鼠中，乳腺癌、肺癌、腮腺腫瘤等癌癥的發(fā)病率均明顯高于正常小鼠[16]。本研究實驗結(jié)果提示在PA和CA-EX-PA組織中PINK1和Parkin蛋白表達顯著低于正常組織。PINK1基因在PA和CA-EX-PA組織中低表達可能是因為PA組織的迅速生長，細胞需要降低線粒體自噬水平來適應低氧和營養(yǎng)缺乏等環(huán)境。

Spearman相關系數(shù)檢驗結(jié)果顯示，在癌組織中PINK1和Parkin在CA-EX-PA中表達呈正相關（r=0.691,P=0.010），說明兩者的低表達可以降低CA-EX-PA線粒體自噬活性，與CA-EX-PA的發(fā)生、發(fā)展密切相關，兩者的聯(lián)合檢測對CA-EX-PA的治療效果及預后具有重要的參考價值。淋巴轉(zhuǎn)移是判斷腮腺惡性腫瘤預后的重要指標，本研究證實，在CA-EX-PA組織中，PINK1和Parkin蛋白的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤侵襲性顯著相關。

在PA和CA-EX-PA組織中PINK1和Parkin蛋白表達明顯降低，說明腮腺腫瘤的發(fā)生、演進和惡化可能和線粒體自噬活性降低相關，因此同時檢測PINK1和Parkin蛋白表達水平可以更加客觀準確地評估腮腺惡性腫瘤患者的預后，從而制定合理、有效的治療方法，以提高患者的生存率。線粒體自噬的具體調(diào)控機制尚未完全明確，仍需進一步研究，為腮腺腫瘤的治療提供新的靶點和新思路。