王夢欣，梁至潔,2*，黃東琳，萬言，蔣洪棉，黎洪棉，陳茂劍，韋長元

0 引言

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）被認為是癌細胞獲得轉(zhuǎn)移侵襲能力的生物學(xué)行為基礎(chǔ)[1]，眾多細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子參與了癌細胞EMT的調(diào)控[2]。近年來也有學(xué)者逐漸發(fā)現(xiàn)一些藥物或者治療手段可以通過逆轉(zhuǎn)細胞的EMT狀態(tài)從而達到降低細胞耐藥性和殺傷細胞的目的[3]。

乳腺癌細胞中異常的DNA復(fù)制與侵襲能力密切相關(guān)。DNA聚合酶-δ（polymerase delta,Pol-δ）是DNA復(fù)制的關(guān)鍵酶，而DNA聚合酶的催化亞基基因POLD1編碼的蛋白P125是Pol-δ的活性亞基之一。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)POLD1在乳腺癌組織中高表達，與患者的臨床分期[4]及細胞的侵襲能力[5]關(guān)系密切，可能是調(diào)控乳腺癌細胞EMT的重要靶點之一。

白藜蘆醇（resveratrol,RSV）已被證實能對乳腺癌細胞的侵襲[6]、EMT[7]及衰老[8]等多種生物學(xué)行為進行調(diào)控，其對乳腺癌的療效是肯定的，進一步探索其中的調(diào)控機制有利于尋找更多的作用靶點和調(diào)控涉及的通路。POLD1是乳腺癌細胞維持腫瘤相關(guān)行為的重要基因，但目前尚無研究指出RSV對POLD1的調(diào)控機制。本研究擬探索RSV對POLD1的調(diào)控作用，并探究POLD1在RSV抑制MDAMB-231細胞侵襲過程中發(fā)揮的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

MDA-MB-231細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。POLD1過表達重組慢病毒顆粒購自上海復(fù)百澳生物科技有限公司。胎牛血清（FBS）、胰酶、DMEM培養(yǎng)基和青、鏈霉素溶液均購自美國Gibco公司。細胞培養(yǎng)瓶、Transwell小室、6孔板、24孔板均購自美國Corning公司?；|(zhì)膠購自美國BD公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）購自索萊寶生物試劑有限公司。實驗所用一抗（GAPDH、POLD1、Vimentin）均購自美國Cell Signaling Technology公司；E-cadherin和N-cadherin均購自美國Abcam公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）、抗鼠IgG（H+L）抗體、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光顯影液均購自碧云天公司。凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100 u/ml+鏈霉素0.1 mg/ml的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中維持生長，2～3天傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。本實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活能力 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104個/毫升，接種于96孔板中，每孔100 μl（共分為7組，每組設(shè)置5個復(fù)孔），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。細胞貼壁后去培養(yǎng)基，按分組分別加入含終濃度為0、1、2.5、5、10、25、50 μmol/L RSV的DMEM 100 μl，另設(shè)空白對照組加入DMEM 100 μl，繼續(xù)以同樣條件孵育48 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)孵育4 h。使用酶標儀檢測450 nm處的吸光度（A）值。比較7組細胞的存活率。實驗重復(fù)3 次。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞以5×104個/孔接種于6孔板內(nèi)。培養(yǎng)12 h后，加入POLD1過表達重組慢病毒（帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein,GFP）標簽），另設(shè)不加病毒的空白對照組和空載陰性對照組，同時加入2 μg/L病毒增強液，12 h后換新鮮完全培養(yǎng)基。72 h后加入嘌呤霉素（2 mg/L）篩選。1周后嘌呤霉素濃度減半繼續(xù)篩選1周。獲得POLD1-OE和POLD1-NC穩(wěn)定細胞株進行后續(xù)實驗。

1.2.4 轉(zhuǎn)染驗證 GFP熒光法測定轉(zhuǎn)染效率：慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h，使用倒置熒光顯微鏡觀察熒光細胞占總細胞數(shù)量比例（即暗場細胞數(shù)與明場細胞數(shù)的比），一般要求熒光細胞比例高于80%。

qRT-PCR實驗法測定轉(zhuǎn)染效率：分別用TRIzol法提取未處理的MDA-MB-231細胞（Ctrl組），POLD1-NC細胞（POLD1-NC組），POLD1-OE細胞（POLD1-OE組）的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄（按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書操作）后，行qRT-PCR實驗（按TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書操作）。

POLD1引物、GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司合成。POLD1上游引物：5′-GCTCCGCTCCTACACGCTCAA-3′；下游引物：5′-GGTCTGGTCGTTCCCATTCTGC-3′。GAPDH上游引物：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’；下游引物：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

1.2.5 Western blot實驗 檢測POLD1、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白在各組細胞中的表達水平（POLD1-NC組、RSV+POLD1-NC組和RSV+POLD1-OE組）。將各實驗組細胞收集于 1.5 ml EP管中，RIPA細胞裂解液裂解，BCA方法測量蛋白濃度，與蛋白上樣緩沖液充分混合后煮沸 5 min使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，利用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉封閉液封閉1.5 h，一抗孵育過夜（4℃）：POLD1、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、GAPDH（體積稀釋比均為1:1 000），次日用TBST浸洗30 min，分別與辣根過氧化物酶標記二抗（1:1 000稀釋）室溫下孵育1 h，TBST浸洗30 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯影液顯影，并在凝膠成像系統(tǒng)中掃描拍照。利用Image lab軟件對Western blot檢測的條帶灰度值進行圖像分析，用GAPDH蛋白表達量進行組間矯正，得到蛋白表達半定量分析柱狀圖。

1.2.6 Transwell侵襲實驗 將Transwell小室置于24孔板中，100 μl基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)基按照1:7比例稀釋，取70 μl稀釋膠均勻鋪到Transwell小室上室。各組細胞用胰酶消化并用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，分別取1×105個/毫升、100 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液600 μl刺激遷移。于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h 后，移除上室細胞。用棉簽擦拭清除上室中未穿膜的細胞后用4%多聚甲醛固定40 min，下室用結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下隨機選取5個視野觀察并計數(shù)穿膜的相對細胞數(shù)量。

1.2.7 劃痕實驗 將各組細胞在6孔板中鋪板，培養(yǎng)至100%融合。融合的單層細胞以100 μl吸頭垂直劃線，再用PBS將劃掉的細胞洗凈，以相應(yīng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。在0和24 h對劃痕進行拍照，用Image J軟件處理圖像，通過對初始劃線（0 h）和后期觀察點（24 h）劃痕的面積對比來計算劃痕愈合率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)統(tǒng)計采取均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV濃度依賴性殺傷MDA-MB-231細胞活性

CCK-8法結(jié)果顯示，RSV對MDA-MB-231細胞具有顯著的殺傷能力，所有RSV刺激組的MDA-MB-231細胞存活率較0 μmol/L組下降，同時細胞的存活率隨著RSV刺激濃度增加而降低，濃度上升至5 μmol/L時開始出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05），說明RSV的腫瘤殺傷力呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖1。我們將25 μmol/L作為后續(xù)實驗濃度。

圖1 不同濃度RSV作用下MDA-MB-231細胞存活率Figure 1 Viability of MDA-MB-231 cells after different concentration of RSV treatment

2.2 綠色熒光觀察

POLD1-NC及POLD1-OE細胞株在普通顯微鏡下可見細胞輪廓突起于表面，熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，帶綠色熒光的細胞比例超過90%，證實90%以上的MDA-MB-231細胞株皆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染POLD1-NC或POLD1-OE，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后GFP表達量 (×100)Figure 2 GFP expression in MDA-MB-231 cells after lentiviral transfection observed under fluorescence microscope (×100)

2.3 qRT-PCR驗證POLD1過表達慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞效率

qRT-PCR實驗結(jié)果顯示：Ctrl組與POLD1-NC組細胞中POLD1 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.954）；而POLD1-OE組細胞中的POLD1 mRNA表達水平顯著高于Ctrl組和POLD1-NC組（均P＜0.001），見圖3。

圖3 qRT-PCR實驗檢測各組細胞的POLD1 mRNA含量Figure 3 mRNA expression level of POLD1 tested by qRTPCR after transfection

2.4 Western blot實驗結(jié)果

相對于POLD1-NC組，RSV+POLD1-NC組及RSV+POLD1-OE組的POLD1蛋白表達水平顯著降低（P=0.003;P=0.013）；相對于RSV+POLD1-NC組，RSV+POLD1-OE組中的POLD1表達水平更高（P=0.007），見圖4。

圖4 Western blot實驗檢測各組細胞中POLD1、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達水平Figure 4 Protein expression levels of POLD1,E-Cadherin,N-Cadherin and Vimentin in each group detected by Western blot

RSV 刺激后，各組E-Cadherin 的蛋白表達顯著升高（均P＜0.001），N-Cadherin及Vimentin可觀察到降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.136;P=0.060）。相對于RSV+POLD1-NC組，RSV+POLD1-OE組中E-Cadherin表達則顯著降低（P＜0.001），N-Cadherin及Vimentin可觀察到升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.879;P=0.054）。相對于POLD1-NC組，RSV+POLD1-OE組中N-Cadherin及Vimentin的表達低于POLD1-NC組（P=0.002;P=0.007），下降幅度小于RSV+POLD1-NC組；E-Cadherin的蛋白表達量可觀察到升高（P＞0.001），見圖4。

2.5 Transwell實驗結(jié)果

結(jié)果表明，POLD1-NC組穿膜細胞為34.5±2.08個，RSV+POLD1-NC組穿膜細胞為21.75±4.99個，RSV+POLD1-OE組穿膜細胞為34.75±3.30個。RSV+POLD1-NC組與其他兩組相比穿膜細胞數(shù)明顯較少（均P=0.001），見圖5。

圖5 Transwell實驗測定各組細胞侵襲能力 (×200)Figure 5 Invasion ability of MDA-MB-231 cells in each group detected by Transwell assay (×200)

2.6 劃痕實驗結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)過24 h愈合時間后POLD1-NC組愈合率為（32.03±2.02）%，RSV+POLD1-NC組愈合率為（13.43±1.53）%，RSV+POLD1-OE組愈合率為（28.35%±0.89）%，RSV+POLD1-NC組與其他兩組相比，愈合率減少（均P＜0.001），見圖6。

圖6 細胞劃痕實驗測各組細胞劃痕愈合率 (×100)Figure 6 Healing rate of MDA-MB-231 cells in each group detected by cell wound scratch assay (×100)

3 討論

POLD1表達水平或活性的升高會引起腫瘤細胞大量增殖，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]，此外其還與癌細胞的侵襲能力密切相關(guān)。Sanefuji等[10]報道，POLD1是評估肝癌細胞活性及侵襲能力的重要指標之一，其表達水平與癌細胞血管侵犯的程度相關(guān)。Sigurdson等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，過度的POLD1表達會增加患乳腺癌的風(fēng)險。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)POLD1不僅在乳腺癌組織中高表達[4]，且高表達的POLD1還常與更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更差的預(yù)后關(guān)系密切（P＜0.05）[12]。同時POLD1還參與了乳腺癌EMT的調(diào)節(jié)過程，沉默乳腺癌細胞中POLD1的表達能夠顯著抑制細胞的遷移侵襲能力[13]。此外POLD1還被發(fā)現(xiàn)與癌細胞的耐藥性相關(guān)，POLD1表達的異?？梢鸺毎退幮栽鰪姡贸齈OLD1表達后細胞的藥敏性可恢復(fù)至正常水平[14]。

EMT被認為是評價耐藥性的指標之一，其機制與EMT癌細胞具有部分腫瘤干細胞（cancer stem cells,CSCs）的特性、耐藥通路激活[15]、高表達ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子（ATP-binding cassette,ABC）蛋白加速了藥物的外流[16]有關(guān)。故而，如何靶向抑制細胞的EMT狀態(tài)從而逆轉(zhuǎn)細胞的耐藥性成為了一些學(xué)者的關(guān)注重點。RSV對癌細胞EMT的抑制或逆轉(zhuǎn)已被廣泛證實[17]，此外還被證實可以通過抑制EMT從而逆轉(zhuǎn)癌細胞對化療藥物的耐藥性[18-19]，因此也被當(dāng)做是一種抑癌治療的增敏劑。

本研究也發(fā)現(xiàn)RSV 能夠顯著抑制MDAMB-231 細胞的侵襲遷移能力，同時下調(diào)N-Cadherin及Vimentin的表達，上調(diào)E-Cadherin的表達，再次驗證了RSV對MDA-MB-231細胞EMT的抑制作用。同時我們還首次發(fā)現(xiàn)了RSV對POLD1蛋白表達水平的下調(diào)作用。如前所述，POLD1與乳腺癌EMT關(guān)系密切，然而POLD1在RSV抑制EMT過程中的作用尚不明確。既往文獻提示RSV的重要靶點P53是調(diào)控POLD1表達的上游因子，而P53是調(diào)控POLD1啟動子活性的關(guān)鍵上游，據(jù)此我們可以推測RSV可能主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控POLD1表達。本研究使用慢病毒構(gòu)建異位表達POLD1的MDA-MB-231細胞株，使細胞在RSV刺激下依然能保持POLD1的表達水平，模擬POLD1上游因子調(diào)控失常的效果。隨后發(fā)現(xiàn)，RSV對POLD1-OE細胞的侵襲遷移能力及EMT水平的抑制作用顯著弱于對正常的MDA-MB-231細胞，說明下調(diào)POLD1可能是RSV抑制MDAMB-231細胞EMT的關(guān)鍵機制之一。

綜上所述，RSV對乳腺癌MDA-MB-231細胞具有殺傷作用，并可能通過下調(diào)POLD1的表達進而抑制MDA-MB-231細胞的EMT過程。此外我們還發(fā)現(xiàn)過表達的POLD1可以在一定程度上拮抗RSV對MDA-MB-231細胞EMT的抑制作用，因此我們推斷POLD1可能是調(diào)控MDAMB-231細胞EMT過程的關(guān)鍵通路之一。由于EMT調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的錯綜復(fù)雜，故本研究還存在一定的局限性，因此，本課題組將進一步探索RSV對乳腺癌MDA-MB-231細胞EMT過程的作用機制，為臨床研發(fā)抗癌新藥和治療靶點提供新的思路。