張桂枝，王 晶，靳雙星*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

免疫應(yīng)激影響畜禽生長(zhǎng)發(fā)育，降低生產(chǎn)性能，增加發(fā)病率和死亡率。研究表明，在飼料或飲水中添加中藥或中藥提取物可以緩解免疫應(yīng)激造成的生產(chǎn)性能下降、免疫功能降低、死淘率增加等負(fù)面效應(yīng)[1-3]。但關(guān)于發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞影響的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。發(fā)酵中藥是利用益生菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的系列酶類(lèi)代謝產(chǎn)物分解植物細(xì)胞壁，促使有效成分溶出[4]；或?qū)⒅兴幹刑穷?lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)一步分解、轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)[5]；或與中藥中的某些特殊成分發(fā)生互作，對(duì)其活性成分進(jìn)行修飾，促使新物質(zhì)的產(chǎn)生[6]。因此，通過(guò)發(fā)酵可以分解中藥的粗纖維，提高藥物溶出度；轉(zhuǎn)化產(chǎn)生新生活性成分；對(duì)大分子物質(zhì)降解，提高吸收率。在豬[7]、禽[8]、奶牛[9]等動(dòng)物上具有較好的利用效果。為尋求綠色安全高效的抗應(yīng)激添加劑，課題組通過(guò)注射脂多糖(LPS)的方法構(gòu)建肉雞免疫應(yīng)激模型，探討發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞的生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響，對(duì)研發(fā)抗免疫應(yīng)激添加劑，消除或減少免疫應(yīng)激的發(fā)生具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥品

免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)和細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2)ELISA檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于南京建成生物工程研究所)，LPS(sigma公司)，雞新城疫疫活苗(LaSota株，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司)。復(fù)方中藥由黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、刺五加、酸棗仁、甘草按一定比例配制而成。取上述復(fù)方中藥調(diào)整物料含水量為50%，pH為6.0左右，按4%接種量(調(diào)整枯草芽孢桿菌∶產(chǎn)朊假絲酵母∶嗜酸乳桿菌=1∶1∶1比例)接入物料中，攪拌均勻后裝入不透氣的塑料袋中，壓實(shí)，封口，置于31 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)72 h，烘干即得[10]。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

1日齡AA 肉雞300只，隔離飼養(yǎng)至7日齡，選取健康肉雞200只隨機(jī)分為5組：對(duì)照組(基礎(chǔ)日糧)和4個(gè)處理組，即Ⅰ組 (基礎(chǔ)日糧+LPS)、Ⅱ組(基礎(chǔ)日糧+LPS+1%未發(fā)酵中藥)、Ⅲ組(基礎(chǔ)日糧+LPS+0.5%發(fā)酵中藥)、Ⅳ組(基礎(chǔ)日糧+LPS+1%發(fā)酵中藥)，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只雞。按常規(guī)方式飼養(yǎng)，自由采食和飲水，7日齡進(jìn)行2倍量新城疫點(diǎn)眼滴鼻免疫接種，21日齡進(jìn)行3倍量新城疫飲水免疫接種。飼養(yǎng)至15、17、19、21、23、25、27日齡，分別按照100、200、200、250、250、400、400 μg/kg的劑量對(duì)4個(gè)處理組腹腔注射LPS，對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

以組為單位，從7日齡開(kāi)始記錄試驗(yàn)雞日采食量，于28日齡，飼喂前稱(chēng)重，計(jì)算平均日增重和料重比。最后一次注射LPS后24 h，每組采集血清16份，每個(gè)重復(fù)2份，按照血凝抑制(HI)試驗(yàn)方法檢測(cè)新城疫抗體效價(jià)；按照ELISA檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明測(cè)定免疫球蛋白和細(xì)胞因子含量。稱(chēng)重、采血后，每組宰殺16只雞，每個(gè)重復(fù)2只，摘取法氏囊、脾臟和胸腺，稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

從表1可看出，Ⅰ組肉雞平均日增重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，料重比與對(duì)照組相比有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；3個(gè)中藥組肉雞的平均日增重顯著高于LPS應(yīng)激組(P<0.05)，而料重比顯著低于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅳ組與Ⅱ組相比肉雞的平均日增重有所提高，料重比有一定的降低，但二者之間差異不顯著(P>0.05)。

表1 肉雞的生長(zhǎng)性能指標(biāo)Table 1 Growth performance of broilers

2.2 發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞免疫功能的影響

2.2.1 新城疫抗體效價(jià)和免疫器官指數(shù) 從表2可看出，Ⅰ組與對(duì)照組相比肉雞新城疫抗體效價(jià)下降1個(gè)滴度；脾臟指數(shù)有所升高，胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)有所下降，但二者差異均不明顯(P>0.05)。與Ⅰ組相比，3個(gè)中藥組不同程度地提高新城疫抗體效價(jià)，Ⅳ組和Ⅱ組新城疫抗體效價(jià)顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；3個(gè)中藥組不同程度地提高脾臟指數(shù)，Ⅲ組肉雞脾臟指數(shù)顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；3個(gè)中藥組不同程度地提高法氏囊指數(shù)，Ⅲ組和Ⅱ組法氏囊指數(shù)極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)。胸腺指數(shù)各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 新城疫抗體效價(jià)和免疫器官指數(shù)Table 2 Newcastle disease antibody titer and immune organ indexes

2.2.2 免疫球蛋白和細(xì)胞因子 發(fā)酵中藥對(duì)肉雞免疫球蛋白和細(xì)胞因子的影響見(jiàn)表3。由表3可看出，Ⅰ組與對(duì)照組相比，肉雞血清中IgM、IgG和IgA濃度均有一定的提高，其中IgM和IgG顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Ⅰ組IFN-γ和IL-2也有一定的提高，但與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。3個(gè)中藥組與Ⅰ組相比，IgM、IgG和IgA濃度均有所下降，添加中藥可以使LPS應(yīng)激引起的IgM和IgG濃度上升幅度降低到與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，Ⅲ組對(duì)IgM濃度恢復(fù)效果更好，Ⅳ組對(duì)IgG和IgA濃度恢復(fù)效果更好。3個(gè)中藥組與Ⅰ組血液中的IFN-γ和IL-2濃度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 免疫球蛋白及細(xì)胞因子Table 3 Immunoglobulins and cytokines

3 討 論

3.1 發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

免疫應(yīng)激可引起甲狀腺激素分泌受到抑制，進(jìn)而使胃腸道蠕動(dòng)速率減緩，胃腸排空延遲，信號(hào)反饋到食欲中樞，從而使采食量下降，是造成生產(chǎn)性能降低的主要原因[1,11-12]。動(dòng)物機(jī)體在沒(méi)有免疫應(yīng)答反應(yīng)的情況下，攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于生命維持代謝和生長(zhǎng)、生產(chǎn)。而在發(fā)生免疫應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體增加了用于維持免疫系統(tǒng)高度激活狀態(tài)的比重，消耗更多的能量來(lái)應(yīng)對(duì)應(yīng)激，減少了用于動(dòng)物生產(chǎn)部分的比重，降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率，可導(dǎo)致生長(zhǎng)性能下降[1,13]。研究表明,加味四君子湯在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)消化吸收功能和免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)代謝等方面具有重要作用，有明顯的促生長(zhǎng)效果[14-15]。本試驗(yàn)所用復(fù)方中藥是在四君子湯的基礎(chǔ)上加減黃芪、酸棗仁、刺五加而成，不僅具有益氣健脾之功效，而且具有鎮(zhèn)靜安神之效果，即可促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)食欲提高采食量，又可使肉雞在免疫應(yīng)激條件下保持安靜，減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗。試驗(yàn)結(jié)果表明：肉雞發(fā)生免疫應(yīng)激時(shí)，平均日增重顯著降低，料重比略有增加，日糧中添加復(fù)方中藥可以克服免疫應(yīng)激帶來(lái)的不良影響，使平均日增重顯著升高和料重比顯著降低。

3.2 發(fā)酵中藥對(duì)免疫應(yīng)激肉雞免疫功能的影響

新城疫HI抗體滴度高低是衡量機(jī)體特異性體液免疫的重要指標(biāo)[16]。馬邯生等[17]研究報(bào)道脂多糖(LPS)應(yīng)激可顯著降低肉仔雞新城疫疫苗免疫效果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示肉雞發(fā)生LPS應(yīng)激時(shí)新城疫抗體效價(jià)降低；與LPS應(yīng)激組相比，中藥組新城疫抗體效價(jià)顯著提高(P<0.05)。說(shuō)明復(fù)方中藥可以對(duì)抗LPS應(yīng)激影響，促進(jìn)機(jī)體免疫抗體產(chǎn)生。

免疫器官指數(shù)是評(píng)價(jià)畜禽免疫狀態(tài)的主要指標(biāo)。胸腺和法氏囊是家禽的中樞免疫器官，是免疫細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育、分化和成熟的主要場(chǎng)所；脾臟是外周免疫器官，是成熟T、B淋巴細(xì)胞移居和接受抗原刺激后發(fā)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，通常認(rèn)為免疫器官指數(shù)增加可間接說(shuō)明機(jī)體免疫功能增強(qiáng)[18]。LPS應(yīng)激對(duì)免疫器官指數(shù)的影響報(bào)道不一，劉水平等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量 LPS組對(duì)胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)影響差異不顯著，但能夠顯著提高脾臟指數(shù)；中劑量 LPS組可以提高胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)；馬邯生等[17]研究報(bào)道，LPS應(yīng)激能顯著降低肉仔雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)，提高肝臟指數(shù)。鄭肖川[20]研究發(fā)現(xiàn)，注射LPS造成脾臟指數(shù)顯著升高，與應(yīng)激組相比，飼糧中添加冬凌草甲素能夠緩解LPS應(yīng)激造成的脾臟指數(shù)的升髙。劉磊等[21]研究表明，免疫應(yīng)激顯著提高肉雞脾臟指數(shù)，而不影響胸腺和法氏囊指數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS應(yīng)激肉雞的脾臟指數(shù)有一定升高，胸腺和法氏囊指數(shù)有一定下降，但差異不顯著(P>0.05)。與LPS應(yīng)激組相比，0.5%發(fā)酵中藥組可以使肉雞脾臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)；0.5%發(fā)酵中藥組和1%未發(fā)酵中藥組極顯著增加法氏囊指數(shù)(P<0.01)。不同的試驗(yàn)結(jié)果有所差異，可能與LPS處理劑量、處理日齡、處理時(shí)間長(zhǎng)短等有關(guān)。如馬邯生等[17]分別在16、18、20日齡，分別三次腹腔注射100、500、1000 μg/kg的脂多糖；劉磊等[21]分別在22、24和26日齡按500 μg/kg腹腔注射LPS；而本試驗(yàn)則是在15、17、19、21、23、25、27日齡，分別按照100、200、200、250、250、400、400 μg/kg·bw劑量對(duì)4個(gè)處理組腹腔注射LPS，從LPS處理劑量、時(shí)間長(zhǎng)短更趨于模擬是慢性免疫應(yīng)激，免疫器官發(fā)育雖受到一定影響，但在日糧中添加一定劑量的中藥和發(fā)酵中藥，能緩解或克服免疫應(yīng)激造成的不良影響，顯著地增加脾臟和法氏囊指數(shù)。

IgM、IgA和IgG為主要的血清免疫球蛋白，它們是機(jī)體體液免疫的重要參與者?？当＞鄣萚22]研究報(bào)道LPS 攻毒可顯著提高斷奶仔豬的血清 IgG 和 IgM 含量(P<0.05) 。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激使肉雞血清免疫球蛋白IgM和IgG的含量顯著升高(P<0.05)，添加復(fù)方中藥能夠使LPS應(yīng)激引起的IgM和IgG濃度上升幅度降低到與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

在前期研究中，采用本試驗(yàn)發(fā)酵的方法對(duì)加減四君子湯進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明，粗蛋白、粗脂肪含量顯著提高，中性洗滌纖維含量顯著降低；多糖得率和多糖含量極顯著提高[23]。韓春楊等[24]發(fā)現(xiàn)中藥制劑經(jīng)微生物發(fā)酵后一些中藥成分含量增加1～4倍，同時(shí)增加了某些新的藥物成分。谷巍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中藥經(jīng)嗜酸乳桿菌發(fā)酵后主要成分發(fā)生了轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生了一種新的特征吸收峰，同時(shí)引起藥效的變化，對(duì)腹瀉小鼠產(chǎn)生了積極的影響。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，發(fā)酵中藥組和未發(fā)酵中藥組相比在生產(chǎn)性能和免疫功能上對(duì)肉雞影響雖然沒(méi)有達(dá)到顯著水平，但從作用效果看發(fā)酵中藥優(yōu)于不發(fā)酵中藥。

4 結(jié) 論

在肉雞日糧中添加一定量復(fù)方中藥能夠顯著提升免疫應(yīng)激肉雞生產(chǎn)性能，顯著提高新城疫抗體效價(jià)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)。這些結(jié)果說(shuō)明復(fù)方中藥能夠有效緩解LPS應(yīng)激對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響，發(fā)酵中藥優(yōu)于未發(fā)酵中藥。