劉東旭，沙萬里,尹柏雙,李國(guó)江*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.吉林省教育廳預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132101)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circoviruses，PCV)是一種無包膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，可分為兩大類：PCV1和PCV2。PCV1是20世紀(jì)70年從豬腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的與臨床疾病無關(guān)的病毒。相反，PCV2與豬的一系列癥狀有關(guān)，稱之為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine Circovirus Associated Disease，PCVAD)[1]。2016年，美國(guó)發(fā)現(xiàn)了一種新型圓環(huán)病毒-PCV3。研究表明，這種新出現(xiàn)的病毒與豬的急性心肌炎和多系統(tǒng)炎癥的臨床病例有關(guān)[2]。自PCV3在美國(guó)發(fā)現(xiàn)以來，我國(guó)也陸續(xù)在湖北、廣東、河南、上海等多地發(fā)現(xiàn)PCV3[3]。鑒于PCV2過去對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大危害，PCV3一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就引起了我國(guó)研究學(xué)者的高度重視和密切關(guān)注，業(yè)界甚至普遍認(rèn)為PCV3將是繼PCV2之后未來幾年內(nèi)危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)較為嚴(yán)重的傳染病之一。為此，本研究對(duì)2017-2019年收集到的吉林部分地區(qū)10家規(guī)模化豬場(chǎng)的704份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行PCV流行情況調(diào)查，較全面的了解吉林地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)PCV的流行情況，為吉林地區(qū)PCV的預(yù)防和控制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶(含10 x Buffer 25mmo1/LMCl2)、dNTP購自寶生物工程(大連)有限公司溴化乙啶(EB)、瓊脂粉購自維特杰公司。

1.2 病料的收集

2017年1月至2019年12月期間，課題組收集吉林地區(qū)10家規(guī)?；i場(chǎng)的血清樣品704份。同時(shí)記錄每份樣品的基本信息，包括豬的體況、年齡及品種等。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中PCV2、PCV3保守區(qū)進(jìn)行全基因組序列，合成4對(duì)引物，引物序列見表1，引物由長(zhǎng)春庫美生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCV2、PCV3 DNA的提取及陽性率檢測(cè) 按照Universal Genomic DNA Kit試劑盒操作說明書，從血清樣品中提取病毒基因組DNA，用適量的TE溶解，-20 ℃，保存?zhèn)溆?。?yīng)用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR的鑒定，PCR反應(yīng)體系為：2×Ex Taq MasterMix 12.5 μL，上游引物、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 5.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3min，95 ℃ 30s，退火30s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.3.3 PCV流行情況的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)本研究對(duì)PCV的檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)分析2017-2019年吉林地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)的PCV流行情況、日齡分布、發(fā)病季節(jié)及發(fā)病地區(qū)等情況，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果相互間的顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 PCV PCR擴(kuò)增結(jié)果

用PCR的方法對(duì)704份樣品進(jìn)行檢測(cè)。樣品的片段大小分別為330 bp和267 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，結(jié)果如圖1所示。

圖1 樣品PCR鑒定結(jié)果M.DL2000 DNA Marker；1.PCV2 PCR鑒定結(jié)果；2.PCV3 PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR resultM.DL2000 DNA Marker;1.PCR results of PCV2;2.PCR results of PCV3

2.2 PCV混合感染結(jié)果

應(yīng)用引物對(duì)704份樣本提取的病毒基因組進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如表2所示。由表2可知，2017-2019年間PCV2的陽性率為42.0%(296/704)，PCV3陽性率為34.2%(241/704)，PCV2與PCV3混合感染率為22.7%(160/704)。且2018年和2019年P(guān)CV2的感染顯著高于2017年(P<0.05)。

表2 吉林地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)樣品中PCV檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of PCV in large-scale pig farms in some regions of Jilin Province

2.3 各季節(jié)PCV檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)樣品PCV病原體的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)2017-2019年間，吉林地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)PCV感染季節(jié)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3所示。PCV單獨(dú)感染多發(fā)生在秋季：PCV2秋季感染率為48.4%(107/221)，PCV3秋季感染率為39.8%(88/221)。

表3 吉林地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)PCV感染季節(jié)分布情況Table 3 Seasonal distribution of PCV infection in some large-scale pig farms in Jilin Province

2.4 各地區(qū)PCV檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)樣品PCV病原體的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)2017-2019年間，吉林地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)PCV感染主要疫情地區(qū)分布情況進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知，中部地區(qū)是PCV單獨(dú)感染及混合感染主要地區(qū)，該地區(qū)PCV2感染率為56.4%(115/204)，PCV3感染率分別為43.1%(88/204)，混合感染感染率為29.4%(60/204)，感染率顯著高于其他地區(qū)(P<0.05)。

表4 吉林地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)PCV感染主要疫病地區(qū)分布情況Table 4 Distribution of PCV infection in some large-scale pig farms in Jilin Province

2.5 不同年齡豬PCV檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)樣品PCV病原體的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)2017-2019年間，吉林地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)PCV感染不同生長(zhǎng)階段分布情況進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表5所示。由表5可知，PCV2在仔豬中感染率較高，為49.7%(96/193)，而PCV3及PCV2+PCV3混合感染在不同年齡段中的豬群中感染率沒有顯著差異(P>0.05)。

表5 吉林地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)PCV感染不同生長(zhǎng)階段分布情況Table 5 Distribution of PCV infection in different growth stages of some large-scale pig farms in Jilin Province

3 討 論

PCV3是2016年美國(guó)新發(fā)現(xiàn)的一種病毒。自PCV3發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)在巴西、中國(guó)、波蘭和韓國(guó)等多個(gè)國(guó)家檢測(cè)到PCV3的存在[4]，且該病毒從出現(xiàn)豬皮炎與腎病綜合征、流產(chǎn)仔豬以及患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的斷奶仔豬體內(nèi)分離得到，而PCV2檢測(cè)為陰性，這提示PCV3可能為導(dǎo)致豬皮炎與腎病綜合征、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征以及繁殖障礙的病原之一。由于PCV2對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，故學(xué)者們對(duì)這個(gè)新出現(xiàn)的PCV3更為重視。為此本研究對(duì)課題組收集到的，2017-2019年吉林地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)的704血清樣本進(jìn)行PCV病原學(xué)檢測(cè)，較全面的了解吉林地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)PCV的流行情況，為吉林地區(qū)PCV的預(yù)防和控制提供數(shù)據(jù)參考。

從檢測(cè)數(shù)據(jù)可以看出，吉林地區(qū)PCV2與PCV3的混合感染率為22.7%(160/704)，雖然低于湛洋等[5]2014年對(duì)湖南、江蘇、湖北的調(diào)查結(jié)果(PCV3+PCV2為42.9%)，但高于時(shí)慶賀等[6]、趙宇等[7]、葛非非等[8]對(duì)河南、上海、四川的調(diào)查結(jié)果。結(jié)果雖然顯示各地PCV的流行情況均不相同，但表明PCV已在我國(guó)廣泛流行。本研究結(jié)果顯示，PCV3的感染率在2017-2019各年份之間沒有顯著差異，雖然與郭影成等對(duì)吉林省2015-2017年的PCV3調(diào)查結(jié)果不盡相同(2015-2017年P(guān)CV3感染率逐年上升)[9]，但均可以說明吉林省豬場(chǎng)已普遍存在PCV3，且PCV2和PCV3不具有交叉免疫保護(hù)的特點(diǎn)，現(xiàn)有的PCV2疫苗無法對(duì)PCV3的感染提供保護(hù)，從而導(dǎo)致PCV3在豬場(chǎng)內(nèi)大規(guī)模感染，因此實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCV2和PCV3的感染情況，強(qiáng)化生物安全，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善豬場(chǎng)環(huán)境，控制營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)尤為重要。

與2017年相比，2018年及2019年P(guān)CV2的感染率顯著上升(P<0.05)。且PCV2在仔豬中感染率較高，為49.7%(96/193)。分析原因，一方面由于PCV2除了可以水平傳播外，還可以通過精液和胎盤進(jìn)行垂直傳播，并且PCV2在母豬群中隱性感染，導(dǎo)致該病毒通過胎盤傳播給仔豬，從而導(dǎo)致仔豬感染率升高。另一方面豬場(chǎng)環(huán)境中存在PCV2，而豬場(chǎng)對(duì)于豬舍等環(huán)境消毒未到位，導(dǎo)致其感染率上升。對(duì)2017-2019年間，吉林地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)PCV感染季節(jié)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)PCV單獨(dú)感染多發(fā)生在秋季，而與賀會(huì)利對(duì)廣西地區(qū)的PCV流行情況不同(夏季為主要感染季節(jié))[10]，分析原因由于地區(qū)不同，豬場(chǎng)所處的氣候、溫度、濕度也不盡相同，從而導(dǎo)致病毒在不同地區(qū)的高發(fā)季節(jié)不同。且根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室多次對(duì)豬疾病流行情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，吉林中部地區(qū)一直為豬病病原體高感染率地區(qū)，表明中部地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)豬群的飼養(yǎng)管理，必須以預(yù)防為主，采取綜合性防治措施，將豬病的危害降低至最小。