駱金紅，陳 祥，尚以順

(1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

努比亞山羊(Nubian goat)肉質細嫩、乳脂率高、繁殖力強[1]，是從以利比亞為中心的非洲北部地區(qū)引入我國的乳肉皮兼用型山羊品種，以胎產(chǎn)1羔或2羔占比較多，部分可胎產(chǎn)3羔或4羔。如何盡可能的減少由于同期發(fā)情處理、人工輸精等造成的應激以及陰道、子宮等的損傷、感染，保證胚胎的良好發(fā)育及附植，提高努比亞山羊胎產(chǎn)3羔或4羔比例，對于山羊養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。NAC(N-acetylcysteine，NAC)分子式為C5H9NO3S，相對分子質量163.2，是左旋精氨酸的天然衍生物，是還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)與天然L-半胱氨酸的前體，是一種含活性巰基化合物，其作用主要有增加細胞外巰基濃度，提高谷胱甘肽-S-轉移酶活性[2-3]，促進細胞內GSH的生物合成[4]，能有效清除細胞內自由基，具有良好的抗氧化作用[5]，可有效的減少子宮內感染并抑制炎癥以促進生殖[6]。團隊前期的研究結果表明，努比亞山羊妊娠早期飼糧中添加0.07%的NAC提高了胎產(chǎn)羔數(shù)，通過子宮轉錄組測序結果我們推測其可能是通過促進/抑制發(fā)育和免疫兩類相關基因的表達發(fā)揮作用，并從中篩選出了免疫相關基因CCL21和CCL26。

CCL21和CCL26同屬CC類趨化因子家族成員，家族28個成員同源性為25%～70%，N端第1或第2個Cys(半胱氨酸)相連[7]。自1955年第一個趨化因子(CXCL4)發(fā)現(xiàn)以來[8]，現(xiàn)在已經(jīng)相繼發(fā)現(xiàn)了趨化因子家族成員50多種，相關受體家族成員20多種。趨化因子是一類低分子分泌蛋白，能趨化細胞向感染或其他特殊器官、部位的移行；趨化因子受體是一類GTP-蛋白偶聯(lián)的跨膜受體，介導趨化因子的功能行使，通常在內皮細胞、免疫細胞等細胞膜上表達[9]。趨化因子和與之對應的GTP-蛋白偶聯(lián)受體結合，在免疫細胞的發(fā)育、分化調控、定向遷移等方面發(fā)揮作用[10]。CCL21是次級淋巴組織趨化因子，屬于CC類趨化因子家族中成員，在扁桃體、淋巴結、淋巴內皮、脾臟T細胞富集區(qū)及非淋巴組織的內皮淋巴導管中特異性高表達[11]，基因位于染色體9p13.3。CCR7是CCL21的高親和力受體，二者結合后可趨化B細胞、T細胞、NK細胞、樹突細胞等多種免疫細胞，參與自身相關免疫反應、病變[12]。CCL21與其他趨化因子比較有兩個不同特點，一是對中性粒細胞、單核細胞無趨化作用[13]，二是可通過促進血管抑制因子的分泌抑制血管生成[14]。CCL26基因位于染色體7q11.23，編碼巨噬細胞炎性蛋白，作用于嗜酸性粒細胞、T細胞，是受體CCR3的激動劑，也是受體CCR5、CCR2、CCR1的拮抗劑[15]，通過調控細胞的生長和轉移在腫瘤細胞的增殖和炎性細胞的趨化等病理生理過程中發(fā)揮重要作用[16]。

本試驗通過實時熒光定量PCR技術對CCL21和CCL26基因在努比亞山羊垂體、輸卵管、子宮、下丘腦、卵巢5個性腺軸組織的表達量進行分析，研究結果可為揭示NAC通過免疫相關調節(jié)在提高努比亞山羊產(chǎn)羔數(shù)中的作用機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在貴州某畜牧業(yè)開發(fā)有限公司春季(5月)選取配種后健康的經(jīng)產(chǎn)努比亞山羊(產(chǎn)2～4胎)母羊32只，平均隨機分為試驗組和空白組，試驗組在飼糧中添加0.07%的NAC，空白組正常飼喂。配種當天記為第0天，從第1天開始飼喂NAC，第30天時試驗組和空白組各隨機選取3只羊頸靜脈放血處死后采集垂體、輸卵管、下丘腦、卵巢、子宮5個組織，錫箔紙封裝、編號放入液氮中，帶回實驗室后立即轉入-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要儀器

微量移液器(型號Eppendorf)，購自德國艾本德公司；PCR擴增儀(型號C1000 TouchTM)、凝膠成相系統(tǒng)(型號Universal Hood II)、電泳儀(型號PowerPacTM HV Power Supply)、實時熒光定量PCR儀(型號CFX96 Real-Time System)，均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 主要試劑

1.4 組織RNA的提取

采用TRIzol法提取組織總RNA，按照組織磨粉、TRIzol裂解、氯仿分相、離心、異丙醇沉淀核酸、離心、75%乙醇去除雜質及洗去氯仿及異丙醇、離心、DEPC水溶解及孵育步驟獲得組織RNA。獲得的RNA用紫外分光光度計進行濃度和純度檢測，1%的瓊脂糖凝膠檢測RNA特異性，分裝保存。

采用PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒(ThermoFisher，美國)將檢測合格的總RNA反轉錄為cDNA。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1 引物的設計 依據(jù)GenBank中收錄的山羊CCL21(登錄號為JO580733.1)、CCL26(登錄號為JO579875.1)和β-actin(登錄號為NC_030832.1)基因序列及其mRNA序列，利用NCBI中Primer-BLAST在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計特異性熒光引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，具體序列見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5.2 實時熒光定量PCR 根據(jù)SYBR Green 1試劑盒的方法及體系推薦，將cDNA模板用CFX 96 Real-Time PCR檢測系統(tǒng)，運用單因素變量的方法對最佳退火溫度、最適引物濃度進行摸索、優(yōu)化，確定試驗的最佳退火溫度和最適引物濃度。實時熒光定量PCR擴增體系(總體積為20 μL)：各組分為2×T5 Fast qPCR Mix(1×)10 μL ，上下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，50×ROX Reference Dye I(1×)0.4 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水7 μL。實時熒光定量PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性13 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共43個循環(huán)；95 ℃，15 s，最后按0.5 ℃/s從65 ℃緩慢上升到95 ℃進行溶解曲線分析，熒光采集時間為5 s。本試驗每個樣品進行3管平行實驗，所用引物濃度為100 ng/μL。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

根據(jù)2-△△Ct法分析CCL21和CCL26基因表達量，組內比較用單因素方差分析(Duncan法)，組間分析用配對樣本t檢驗進行分析，組內、組間分析均用SPSS 20.0進行分析，P<0.05代表差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 CCL21基因在不同組織的表達分析

由圖1可知，對空白組和試驗組努比亞山羊垂體、輸卵管、子宮、下丘腦、卵巢5個性腺軸組織中CCL21基因表達量進行分析，CCL21基因在空白組和試驗組努比亞山羊的5個組織中均有表達。CCL21在空白組垂體中表達量高于下丘腦和子宮(P<0.05)，高于卵巢和輸卵管(P<0.01)，由高到低依次為垂體>下丘腦>子宮>卵巢>輸卵管；試驗組垂體中表達量高于子宮、卵巢、輸卵管(P<0.01)，下丘腦中表達量高于子宮、卵巢、輸卵管(P<0.05)，由高到低依次為下丘腦>垂體>子宮>卵巢>輸卵管；組間比較，相同組織之間表達量無顯著變化(P>0.05)。

圖1 努比亞山羊不同組織中的CCL21基因的相對含量同組不同組織柱標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同組同一組織比較有無“*”表示差異顯著(P<0.05)。下同。Fig.1 The relative expression of CCL21 gene in different tissues of Nubian goatsDifferent uppercase letters in different tissues in the same group indicate a significant difference (P<0.01),and different lowercase letters indicate a significant difference (P<0.05);the presence or absence of “*” in the same tissue in different groups indicates a significant difference (P<0.05).The same below.

2.2 CCL26基因在不同組織的表達分析

由圖2可知，CCL26基因在空白組和試驗組努比亞山羊的5個組織中均有表達。在空白組中，CCL26基因在垂體中表達量高于輸卵管、下丘腦、卵巢、子宮(P<0.01)，下丘腦中表達量高于輸卵管、卵巢(P<0.05)，由高到低依次為垂體>下丘腦>子宮>卵巢>輸卵管；在試驗組中，垂體、下丘腦中表達量均高于輸卵管、卵巢(P<0.01)，下丘腦中表達量高于輸卵管、卵巢、子宮(P<0.05)，由高到低依次為垂體>下丘腦>卵巢>子宮>輸卵管；組間比較，卵巢組織中表達量試驗組高于空白組(P<0.05)，其他4個組織表達量無顯著變化(P>0.05)。

3 討 論

NAC不僅在抑制炎癥、細胞凋亡、呼吸道感染、肝臟保護等方面具有一定的作用[17]，在減輕胎兒(胚胎)畸形[18]、提高胚胎存活和預防早產(chǎn)[19-20]等繁殖方面的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。田見暉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，補充NAC能促進小鼠和豬胚胎附植，提高了其窩產(chǎn)仔數(shù)。本試驗中趨化因子基因CCL21和CCL26就是在妊娠早期補充NAC提高努比亞山羊產(chǎn)羔數(shù)基礎上通過子宮轉錄組測序篩選獲得，且本試驗結果與轉錄組測序結果上、下調趨勢一致。

Tríbulo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CCL21在發(fā)情周期第0天的荷斯坦牛輸卵管和子宮內膜中高表達，CCL26在相同狀態(tài)的子宮內膜中高表達，提示CCL21、CCL26可能在繁殖性能方面也發(fā)揮某些未知作用。本試驗中CCL21、CCL26在試驗組和空白組性腺軸組織垂體和下丘腦中高表達，子宮、卵巢、輸卵管中相對低表達，說明妊娠期垂體和下丘腦趨化活動較靶器官子宮、卵巢、輸卵管中更頻繁，這可能與垂體和下丘腦在妊娠期間發(fā)揮更重要的調控作用有關。研究表明，許多自身免疫性疾病和慢性炎癥與趨化因子或趨化因子受體的不適當調節(jié)有關[23]。Lee等[24]研究發(fā)現(xiàn)，類風濕關節(jié)炎患者CCL21和其受體CCR7的表達量高于骨關節(jié)炎患者和空白組，且發(fā)現(xiàn)依賴于CCR7的CCL21提高了骨吸收的活性和破骨細胞的移行能力。魏蔚霞等[25]研究發(fā)現(xiàn)，盆腔子宮內膜異位癥(EMS)患者子宮內膜組織及腹腔液中CCL21高表達，且與EMS呈正相關。本試驗組間比較發(fā)現(xiàn)，飼喂NAC對CCL21表達無顯著影響。CCL26 能夠介導炎性細胞的趨化、腫瘤細胞的增殖等生理病理過程，特別是調節(jié)腫瘤細胞的生長和轉移能力[26]，本試驗組間比較發(fā)現(xiàn)，NAC的飼喂降低了垂體、輸卵管、子宮中CCL26基因表達量，增加了下丘腦、卵巢中的表達量，且在卵巢組織中達到差異顯著水平(P<0.05)，結合產(chǎn)羔數(shù)的提高，推測CCL26對某些未知的繁殖調控因子也具有趨化作用，進而保證了胚胎的良好發(fā)育和存活，提高了努比亞山羊產(chǎn)羔數(shù)，但NAC的飼喂是否有增加卵巢發(fā)生炎癥的可能需要更進一步同時研究。

4 結 論

CCL21、CCL26基因在努比亞山羊垂體、輸卵管、子宮、下丘腦、卵巢5個性腺軸組織中均有不同的表達；在飼喂NAC后，組織中CCL21的表達沒有受影響，但顯著上調了卵巢CCL26的表達，即NAC可通過卵巢CCL26對生殖功能進行調節(jié)。