王 嘉，田東倩，魏英粉，楊澤垠，邸 斌

慢性鼻-鼻竇炎是一種鼻腔和鼻腔黏膜持續(xù)性的炎癥疾病，慢性鼻-鼻竇炎包括兩大類，慢性鼻-鼻竇炎伴息肉和慢性鼻-鼻竇炎不伴息肉[1]。兩種類型的慢性鼻-鼻竇炎發(fā)病機(jī)制不同，慢性鼻-鼻竇炎伴息肉的發(fā)病機(jī)制存在多種說(shuō)法，總而言之是炎癥的過(guò)程，與鼻黏膜上皮反應(yīng)密不可分，比如免疫缺陷、細(xì)菌和直菌定植、上皮防御功能降低和天然免疫功能降低等[2]。鼻黏膜上皮重要的功能需要細(xì)胞之間緊密連接，緊密連接構(gòu)建了氣道和上皮組織間和氣道的物理屏障。鼻黏膜上皮是接受外界環(huán)境刺激的屏障，接受外界環(huán)境刺激后會(huì)導(dǎo)致下游的一系列的炎癥反應(yīng)，這有可能是慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病機(jī)制啟動(dòng)的關(guān)鍵因素[3]。但鼻息肉黏膜上皮變化如何引發(fā)的鼻息肉目前還未闡明。需要今后更多的研究。乏氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)在腫瘤中的相關(guān)報(bào)道較多，通常在氧濃度為5%時(shí)檢測(cè)到較高蛋白表達(dá)水平[4]。5-脂加氧酶(Alox5)屬于一種多形核蛋白，是巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá)的膜結(jié)合蛋白，在很多腫瘤中高表達(dá)，比如前列腺癌和胰腺癌[5]。但目前關(guān)于HIF-1α和Alox5在鼻竇炎中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究探討HIF-1α和Alox5在慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病機(jī)制中的作用，為臨床慢性鼻-鼻竇炎伴息肉的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例資料 研究中涉及的組織標(biāo)本，選取2019年1～10月在醫(yī)院接受手術(shù)治療的26例慢性鼻-鼻竇炎伴息肉患者的標(biāo)本為鼻息肉組，選擇同期20例鼻竇炎但無(wú)鼻息肉患者的竇黏膜組織為無(wú)鼻息肉組，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書(shū)。所有患者通過(guò)鼻竇CT檢查或者鼻內(nèi)鏡檢查確診，其診斷參照《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[6]。鼻息肉組男17例，女9例，平均年齡(44.19±7.36)歲；無(wú)鼻息肉組男16例，女4例，平均年齡(43.57±6.94)歲。另選同期接受治療的20例鼻中隔手術(shù)或鼻竇囊腫患者的鉤突或中鼻甲黏膜組織作為對(duì)照組，男14例，女6例，平均年齡(42.97±7.15)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病程已經(jīng)超過(guò)12 w；（2）有鼻塞、黏性或黏性膿腫鼻涕等癥狀；（3）鼻竇CT檢查或者鼻內(nèi)鏡檢查確診；（4）經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合慢性鼻-鼻竇炎伴息肉診斷的患者；（2）接受過(guò)鼻腔減充血?jiǎng)┗蛱瞧べ|(zhì)激素治療的患者。

1.2 材料和儀器 蘇木素染液購(gòu)于杭州蕭山化學(xué)試劑廠；Alox5抗體購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；HIF-1αshRNA重組質(zhì)粒和空載（陰性對(duì)照）由吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)合成；鼠抗人HIF-1α單克隆抗體、1L-4、1L-13、1L-17A抗體購(gòu)自美國(guó)R&D Systems Inc公司；離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Ependorf公司；倒置光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)購(gòu)于德國(guó)Leica公司。

1.3 HE染色 把標(biāo)本組織采用4%的多聚甲醛固定,然后進(jìn)行酒精脫水，二甲苯透明，在進(jìn)行石蠟包埋，切成4μm薄片進(jìn)行HE染色，烤片，脫蠟、蘇木素染5 min,伊紅染2 min,PBS沖洗3次，觀察嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 4%的多聚甲醛固定,流水沖洗，4 h固定組織，乙醇浸泡2 h，脫水透明，然后包埋蠟塊，切成4μm的薄片，烤片，PBS沖洗，抗原，滴入3%的雙氧水溶液，孵育15 min，鼠抗人HIF-1α單克隆抗體按照1∶100稀釋，滴加在盒內(nèi)，在將切片放入濕盒內(nèi)，室溫孵育30 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素在切片上，1∶200稀釋，沖洗5 min，DAB溶液進(jìn)行發(fā)光，應(yīng)用蘇木素染色，應(yīng)用鹽酸酒精進(jìn)行分化，不同濃度酒精脫水干燥，透明處理，中性樹(shù)膠，顯微鏡下閱片，HIF-1α陽(yáng)性染色呈現(xiàn)褐色，使用Image pro-P1us6.0軟件處理免疫組化圖片，IOD為測(cè)量的分子的值，計(jì)算平均光密度(IOD/area)。

1.5 Western blot檢測(cè) 取標(biāo)本迅速放入PBS緩沖液的EP管中，在將組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌平皿中反復(fù)沖洗，將組織剪切成小塊，浸在0.25%的胰蛋白酶中，消化后，吹打至上皮片脫落，棄掉組織塊，將細(xì)胞懸液膠乳胰蛋白酶和胎牛血清，離心處理后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為兩組，陰性對(duì)照組和siHIF-1α組，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，siHIF-1α組HIF-1αshRNA重組質(zhì)粒。進(jìn)行蛋白進(jìn)行提取,采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂乳封閉膜,在4℃下,添加一抗Alox5(1:500稀釋)孵育過(guò)夜,二抗孵育2 h,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑,β-actin作內(nèi)參,檢測(cè)Alox5蛋白表達(dá)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè) 將鼻息肉標(biāo)本的提取RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,按照試劑的使用說(shuō)明進(jìn)行嚴(yán)格操作,用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對(duì)1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平進(jìn)行檢測(cè),1L-4 mRNA上游5'-GTAGGCCATTTGAGAATCCT-3',下游5'-GTTCCA TTGGAACCHAACCGT-3';1L-13 mRNA上游5'-GGA ATGCCACAAGATTCTACT-3',下游5'-GCTTAGGAC CTTGGCCAGTT-3';1L-17A mRNA上游5'-GGTTCG CGCGAATAGCTTACGT-3',下游5'-GATGAATTGGTT AGAGCGCGATG-3';β-actin作為內(nèi)參,引物序列為上游5'-ACCATCTTHGATCACCTCTATC-3',下游5'-GC GCGCTATAGATACAGTCCATAGC-3',反應(yīng)條件為95℃,10 min、80℃,30 min、72℃,20 s、65℃,5 min,循環(huán)次數(shù)為40次,用相對(duì)定量2-ΔΔCT計(jì)算1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平。同時(shí)對(duì)陰性對(duì)照組和siHIF-1α組中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，方法同上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間資料比較采用t檢驗(yàn)，多組間資料比較采用SNK-q檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻息肉組織病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組和無(wú)鼻息肉組相比，鼻息肉組的嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 鼻息肉組織HE染色（×100）

2.2 鼻息肉組織中HIF-1α的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、無(wú)鼻息肉組和鼻息肉組中HIF-1α的IOD值分別為0.14±0.02、0.21±0.02和0.46±0.03，無(wú)鼻息肉組中的HIF-1α的IOD值明顯高于對(duì)照組（P<0.05），鼻息肉組的HIF-1α的IOD值顯著高于無(wú)鼻息肉組（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 鼻息肉組織中HIF-1α的表達(dá)（×100）

2.3 炎癥因子在鼻息肉組織中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,無(wú)鼻息肉組中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P<0.05），鼻 息 肉 組 中 的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于無(wú)鼻息肉組（P<0.05）。見(jiàn)表1和圖3。

表1 炎癥因子的表達(dá)

2.4 抑制HIF-1α對(duì)Alox5表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組和siHIF-1α組的蛋白表達(dá)分別為3.76±0.07和0.11±0.01，siHIF-1α組中Alox5蛋白表達(dá)水平顯著低于陰性對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 炎癥因子在鼻息肉組織中的表達(dá)

圖4 Alox5蛋白表達(dá)

2.5 抑制HIF-1α對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比，siHIF-1α組中1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表2和圖5。

表2 HIF-1α對(duì)炎癥因子表達(dá)

圖5 炎癥因子的相對(duì)表達(dá)

3 討論

慢性鼻-鼻竇炎伴息肉是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，嚴(yán)重的影響了患者的生存質(zhì)量[7]。中鼻道和鼻竇是鼻息肉發(fā)病的主要部位，這可能與中鼻道纖毛分布不均勻，清除微生物的能力差及鼻黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)乏氧等微環(huán)境相關(guān)[8]。由于此原因，鼻黏膜上皮免疫功能較弱，當(dāng)微生物入侵該位置時(shí)，會(huì)加引發(fā)鼻黏膜上皮炎癥。相關(guān)研究表明，HIF-1α能夠介導(dǎo)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,而人類鼻黏膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞是鼻息肉組織重塑的主要原因[9]。所以抑制HIF-1α可能成為治療慢性鼻-鼻竇炎伴息肉的新靶點(diǎn)。Alox5含有非血紅素鐵的雙加氧酶，也會(huì)炎癥介質(zhì)的起始酶。相關(guān)研究表明，Alox5與很多疾病的發(fā)病相關(guān)，比如心血管疾病、變應(yīng)性鼻炎以及腫瘤等[10]。但Alox5的表達(dá)至今未在慢性鼻-鼻竇炎伴息肉中出現(xiàn)過(guò)相關(guān)報(bào)道，本研究主要探討慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病中HIF-1α的表達(dá)及對(duì)Alox5和炎癥因子分泌的影響，為臨床在慢性鼻-鼻竇炎伴息肉靶向治療方面提供可靠依據(jù)。

嗜酸性粒細(xì)胞的激活和募集是嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的主要特征，嗜酸性粒細(xì)胞炎癥與輔助的T細(xì)胞和HIF-1α表達(dá)關(guān)系密切[11]。本研究通過(guò)HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組和無(wú)鼻息肉組相比，鼻息肉組的嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多。為了驗(yàn)證HIF-1α在鼻息肉組織中的表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)，結(jié)果顯示，無(wú)鼻息肉組中的HIF-1α的IOD值明顯高于對(duì)照組，鼻息肉組的HIF-1α的IOD值顯著高于無(wú)鼻息肉組。從而說(shuō)明鼻息肉的患者中HIF-1α表達(dá)明顯升高，相關(guān)研究報(bào)道，鼻息肉組織與健康黏膜組織相比，HIF-1α的表達(dá)顯著增高[12]。鼻黏膜上皮是抵抗鼻腔微環(huán)境的第一道防線，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，通過(guò)合成和分泌相關(guān)細(xì)胞因子啟動(dòng)下游的免疫反應(yīng)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在鼻息肉的血管內(nèi)的血管細(xì)胞中也呈現(xiàn)高表達(dá)[14]。

研究表明，慢性鼻-鼻竇炎伴息肉是一種T細(xì)胞型細(xì)胞炎癥為主的疾病，表現(xiàn)為相關(guān)的細(xì)胞因子升高，以IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17a、IL-1b和IFN-γ分泌為主[15]。本實(shí)驗(yàn)僅研究了鼻息肉組中的1L-4、1L-13、1L-17A的表達(dá)，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，無(wú)鼻息肉組中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，鼻息肉組中的1L-4、1L-13、1L-17A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于無(wú)鼻息肉組。不僅說(shuō)明了鼻息肉的患者中1L-4、1L-13和1L-17A的表達(dá)明顯升高，而且也說(shuō)明1L-4、1L-13和1L-17A參與了鼻息肉炎癥的變化。有研究證實(shí)，鼻息肉上皮細(xì)胞中HIF-1α與IL-17A分泌在低氧刺激時(shí)具有明顯相關(guān)性，推測(cè)抑制1L-17A炎癥反應(yīng)，就抑制了淋巴血管生成[16]。進(jìn)而采用沉默siHIF-1α表達(dá)， 驗(yàn)證HIF-1α與1L-4、1L-13和1L-17A的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默HIF-1α的表達(dá)，能夠有效抑制1L-4、1L-13和1L-17A的水平，從而抑制了炎癥反應(yīng)。同時(shí)也通過(guò)Western blot檢測(cè)證明發(fā)現(xiàn)，沉默HIF-1α的表達(dá)，也能夠降低Alox5蛋白表達(dá)。相關(guān)研究表明，在甲狀腺癌中誘導(dǎo)Alox5可有誘導(dǎo)炎癥的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲，反之，抑制Alox5的表達(dá)，可以抑制炎癥反應(yīng)[17]。

綜上所述，慢性鼻-鼻竇炎伴息肉中HIF-1α呈現(xiàn)高表達(dá)，沉默HIF-1α，能夠降低Alox5的表達(dá)和炎癥因子分泌，其機(jī)制可能通過(guò)抑制Alox5來(lái)降低炎癥因子的分泌。HIF-1α和Alox5可能成為慢性鼻-鼻竇炎伴息肉發(fā)病機(jī)制的重要靶點(diǎn)。