熊明國， 高欣梅

(商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 河南 商丘 476006)

0 引言

【研究意義】草莓具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，在我國的水果產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。近年來，草莓種植業(yè)得到快速發(fā)展，種植面積不斷增加，主要以塑料大棚、日光溫室種植方式為主，高濕、連作重茬等導(dǎo)致草莓根部病害加重，對草莓的品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】草莓根腐病是常見的土傳病害，病原菌種類超過20種[1]。目前已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致草莓根腐病發(fā)生的病原菌多達(dá)20余種[2-3]，且不同地區(qū)和品種間的致病菌種類差異較大。有研究指出，河南省商丘市草莓豐香根腐病病原菌主要是鏈格孢菌[4]；北京地區(qū)草莓根腐病的病原菌為雙核絲核菌[5-6]，而河北承德地區(qū)的病原菌為立枯絲核菌[5]；安徽省長豐縣草莓根腐病病原均為尖孢鐮刀菌[7]；山東省青島市草莓根腐病的病原菌有棒形擬盤多毛孢菌、膠孢炭疽菌[8]。目前，治療草莓根腐病多采用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。由于市面上常見的藥劑類型多樣，病原菌具有多樣性、根腐病發(fā)病具有滯后性，加之頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥等原因，導(dǎo)致抗藥性加快，防治效果不理想[9]。【研究切入點】河南省南陽市素有“草莓之鄉(xiāng)”之稱，但是近年來草莓根腐病頻繁發(fā)生，病情嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致絕收[4]。目前，針對河南省南陽市草莓根腐病的病原菌鑒定和防治研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】于2018年10月在河南省南陽市唐河縣代莊村種植園采集具有草莓根腐病典型癥狀的發(fā)病植株，通過病原菌分離純化、致病性檢測結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定等對其致病病原菌種類進(jìn)行鑒定，同時采用室內(nèi)毒力測定與田間防治相結(jié)合，對比和分析甲基硫菌靈、殺毒礬、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢桿菌等6種藥劑的防治效果，以期為有效控制當(dāng)?shù)丶邦愃频貐^(qū)的草莓根腐病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株樣品 2018年10月于河南省南陽市唐河縣代莊村連作3年的草莓種植園采集具有典型癥狀的發(fā)病植株，品種為豐香和隋珠，各品種長勢均勻，處于收獲初期。

1.1.2 試劑 馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)基，自制；察氏(Czapek)培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司；ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)通用引物，北京天根公司。

1.1.3 藥劑 70%甲基硫菌靈(施用劑量1 200 g/hm2)，河北青園有限公司；殺毒礬(有效成分56%代森錳鋅+8%惡唑烷酮，施用劑量3 000 g/hm2)，安陽市五星農(nóng)藥廠；15%多抗霉素(施用劑量15 000 g/hm2)，山東省德州祥龍生化有限公司；3億孢子/g哈茨木霉(施用劑量1 500 g/hm2)，濟(jì)寧玉園生物科學(xué)有限公司；0.1億孢子/g寡雄腐霉(施用劑量300 g/hm2)，北京比奧瑞生物科技有限公司；1 000億芽孢/g枯草芽孢桿菌(施用劑量1 500 g/hm2)，河北閏沃生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用組織分離法[10]對病原菌進(jìn)行分離。用清水洗凈患病草莓植株根部，于病健交界位置剪取長約0.5 cm的組織，先放入70%乙醇中消毒10 s，再放入0.1% HgCl2中浸泡30 s，無菌水沖洗并用無菌濾紙吸干水分后，將其接種至PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。待菌落長出后，用接種環(huán)挑取少量菌落進(jìn)行純化，獲得菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的致病性檢測 純化后菌株的形態(tài)特征與培養(yǎng)性狀完全一致，隨機(jī)挑選3個菌株M1、M2和M3，采用傷根接種法測定其致病性[11-14]。菌株接種至PDA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)7 d，用打孔器打取直徑5 mm的菌餅備用，同時制備濃度1.5×107個/mL的孢子懸浮液備用。于草莓根部造成微傷口，每株灌入孢子懸浮液25 mL，3次重復(fù)，每重復(fù)為3株，以灌入無菌水的處理作對照。將接種植株在22℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，接種2周后調(diào)查發(fā)病情況。將菌餅接種至草莓幼苗上，并置于20℃、70%相對濕度溫室中培養(yǎng)，14 d后觀察草莓植株發(fā)病情況，3次重復(fù)，每重復(fù)處理3株，以未接種的植株作對照。

1.2.3 病原菌鑒定

1) 形態(tài)學(xué)鑒定。將分離的菌株接種至PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)7 d后觀察并記錄菌落的形態(tài)特征。待病原菌產(chǎn)孢后制作玻片，觀察其產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)，根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行病原菌的初步鑒定。

2) 分子生物學(xué)鑒定。將分離的菌株接入Czapek培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)7 d，離心后將沉淀收集，采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA。利用引物ITS1和ITS4對病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為25 μL：10×PCR 緩沖液2.5 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物均0.5 μL，DNA模板0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃延伸6 min，最后于5℃終止反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照，送至上海生工生物工程有限公司測序。用DNAStar對所測得的原始序列進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并將測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行同源性比較，然后利用MEGA 5.1將獲得病菌的ITS序列與NCBI網(wǎng)站上已發(fā)表的相似菌株的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.2.4 藥劑室內(nèi)毒力測定 采用生長速率法[15]測定甲基硫菌靈、殺毒礬、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢桿菌等6種藥劑對分離的草莓根腐病菌的毒力。用PDA培養(yǎng)基配制藥劑培養(yǎng)基平板，無菌水培養(yǎng)基作對照，3次重復(fù)，用打孔器在菌落邊緣切下直徑為70 mm的菌餅接種至培養(yǎng)基平板中央，于25℃培養(yǎng)5 d(對照基本長滿培菌養(yǎng)皿)，采用十字交叉法測出各菌落直徑，并計算抑菌率。

1.2.5 田間防治效果 試驗在河南省南陽市唐河縣代莊村種植園進(jìn)行，豐香(1號棚)和隋珠(2號棚)2個品種各1個棚，試驗各設(shè)7個處理，每個藥劑1個處理，劑量采用生產(chǎn)廠家推薦劑量，以清水噴施為對照(CK)，3次重復(fù)，不設(shè)置濃度梯度，比較甲基硫菌靈、殺毒礬、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢桿菌等6種藥劑對草莓根腐病的防治效果。1號棚、2號棚各小區(qū)面積均為17 m2(6.8 m×2.5 m)。每次重復(fù)處理50株草莓，隨機(jī)區(qū)組排列。2個棚區(qū)的草莓植株長勢一致，各小區(qū)均實施相同的肥水管理，草莓根腐病為自然發(fā)病。各藥劑于草莓定植后7 d進(jìn)行第1次灌根處理，60 d后再施藥1次。于第2次施藥后30 d調(diào)查記錄植株的發(fā)病情況。各小區(qū)均采用對角線五點取樣法，每點取3株，統(tǒng)計并計算發(fā)病率和防效。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

發(fā)病植株地上部分長勢衰弱，葉片下垂，不同程度變黑腐爛，果實無法自然膨大，整株萎蔫(圖1)；地下部分須根較少且較細(xì)，表皮呈現(xiàn)褐色病斑，須根后期變黑并腐爛，表皮與木質(zhì)部發(fā)生分離。從病株上分離到22個菌株，且特征較為一致。由圖1可見，在PDA培養(yǎng)基上生長4 d后，菌落呈白色，菌絲絨狀且大多數(shù)呈分支狀、含有大型分生孢子和小型分生孢子。大型分生孢子較為勻稱，呈鐮刀狀，具有1～4個隔膜，但大多數(shù)具有3～4個隔膜，大小為(23.5～42.8)μm×(2.8～5.6)μm。小型分生孢子呈腎形或卵形，具有0～1個隔膜，大小為(6.6～22.7)μm×(2.3～3.7)μm，產(chǎn)孢細(xì)胞上著生假頭狀。綜合以上形態(tài)學(xué)特征，初步認(rèn)為草莓根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

注：a為草莓根腐病發(fā)病株田間癥狀，b為病原菌菌落，c為病原菌分生孢子。

2.2 病原菌的致病性

從圖2看出，接種21 d后植株的發(fā)病癥狀明顯，葉片的尖部出現(xiàn)脫水并逐漸變?yōu)榛揖G色，最終整株死亡。將發(fā)病植株取出發(fā)現(xiàn)，根系已腐爛變黑。癥狀與草莓根腐病田間自然發(fā)病癥狀一致。對照組生長正常，未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。再次對發(fā)病植株的病變組織進(jìn)行病原菌分離，結(jié)果目標(biāo)分離物的獲得率為100%，表明再分離獲得的菌株與原接種病菌一致，為河南省南陽市唐河縣代莊村種植園草莓根腐病的病原菌。

圖2 回接試驗草莓植株的發(fā)病癥狀

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

從圖3看出，將菌株M1、M2和M3的基因組DNA用rDNA-ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，均得到大小約360 bp的特異性片段，且序列相同，在GenBank中的登錄號分別為MN507109、MN507110和MN507111。利用NCBI數(shù)據(jù)庫，將片段序列進(jìn)行Blast比對，菌株M1、M2和M3的序列與菌株FusariumoxysporumCBS420.90(登錄號：EF056790)和NRRL22518(登錄號：FJ985265)的序列同源性最高，為99%以上。由圖4可知，菌株M1、M2、M3與菌株FusariumoxysporumCBS420.90(登錄號：EF056790)和NRRL22518(登錄號：FJ985265)為同一分支，支持率高達(dá)100%。由此進(jìn)一步確定分離菌株為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

注：M為DNA Marker，1～2泳道為菌株M1，3～4泳道為菌株M2，5～6泳道為菌株M3。

圖4 分離菌株rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 6種藥劑對病原菌的室內(nèi)毒力測定

從圖5看出，6種藥劑對尖孢鐮刀菌均有不同程度的毒力作用，其毒力強(qiáng)度為甲基硫菌靈>哈茨木霉>枯草芽孢桿菌>多抗霉素>殺毒礬>寡雄腐霉。其中，甲基硫菌靈和哈茨木霉的毒力較強(qiáng)，其EC50分別為4.98 mg/mL和38.39 mg/mL；其次為枯草芽孢桿菌和多抗霉素，其EC50分別為57.25 mg/mL和67.98 mg/mL；殺毒礬對尖孢鐮刀菌的毒力相對較弱，其EC50為192.76 mg/mL；寡雄腐霉對尖孢鐮刀菌的毒力較弱，其EC50為610.55 mg/mL。

圖5 6種藥劑對病原菌的毒力強(qiáng)度

2.5 6種藥劑對豐香和隋珠根腐病的防治效果

從表1看出，不同藥劑對同一品種草莓及同種藥劑對不同品種草莓的防治效果均存在差異。其中，殺毒礬對豐香和隋珠均具有良好防治效果，防效均高達(dá)80.16%；甲基硫菌靈和枯草芽孢桿菌對豐香的防治效果也較好，防效也達(dá)80.16%，二者對隋珠的防治效果均為69.95%；哈茨木霉對豐香和隋珠的防治效果均為69.95%；多抗霉素對豐香和隋珠的防治效果分別為69.95%和50.18%；寡雄腐霉對豐香和隋珠的防治效果均較差，分別為50.18%和40.08%。對豐香而言，殺毒礬、甲基硫菌靈和枯草芽孢桿菌的防治效果較好；對隋珠而言，殺毒礬的防治效果較好，其次是甲基硫菌靈、哈茨木霉和枯草芽孢桿菌。

表1 6種藥劑對豐香草莓和隋珠草莓根腐病的防治效果

3 討論

尖孢鐮刀菌可導(dǎo)致草莓植株根部和葉片病害，此外，還可以引起苜蓿[16]、三七[17]、香蕉[18]及西瓜[19]等植株發(fā)病。為了防止發(fā)生病原菌抗藥性和環(huán)境污染，有益微生物防治病害已逐漸成為一種理想的途徑。室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，6種藥劑中甲基硫菌靈對尖孢鐮刀菌的毒力最強(qiáng)，其次為哈茨木霉，枯草芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌的毒力也較強(qiáng)；同時，各藥劑的田間防治結(jié)果表明，6種藥劑對豐香和隋珠2個草莓品種根腐病的防治效果差異較大，其中殺毒礬對豐香和隋珠的防效最佳，甲基硫菌靈、枯草芽孢桿菌對豐香和隋珠的防治效果也較為明顯。由于殺毒礬、甲基硫菌靈為化學(xué)藥劑，長期使用易造成環(huán)境污染和產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，而枯草芽孢桿菌為生物藥劑，且其活性成分主要為生防類芽孢桿菌，可以在土壤、植株體內(nèi)定殖，可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、促進(jìn)植物生長，具有較好的生防能力[20]，可減少農(nóng)藥使用量，降低草莓產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，因此，建議在當(dāng)?shù)卮竺娣e試驗示范推廣應(yīng)用。該研究使用的生防藥劑均為單一菌劑，具有適應(yīng)性不強(qiáng)、需菌量較大等缺陷，今后需要在多菌劑復(fù)合應(yīng)用方向進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

通過對河南省南陽市唐河縣代莊村草莓種植園草莓根腐病樣品進(jìn)行病原菌分離純化，共分離獲得22個菌株，純化后菌株的形態(tài)特征與培養(yǎng)性狀完全一致，形態(tài)學(xué)特征和測量值與尖孢鐮刀菌相符；隨機(jī)挑選3個菌株M1、M2、M3并進(jìn)行rDNA-ITS序列測定，結(jié)果3個菌株的序列與GenBank中尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)對應(yīng)的序列同源性最高，為99%以上；同時，3個菌株的序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為同一分支，支持率高達(dá)100%。由此確定河南省南陽市唐河縣代莊村草莓種植園草莓根腐病由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)侵染所致。室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，甲基硫菌靈對尖孢鐮刀菌的毒力最強(qiáng)，EC50為4.98 mg/mL；哈茨木霉其次，EC50為38.39 mg/mL；枯草芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌的毒力也較強(qiáng)，EC50為57.25 mg/mL。田間防治結(jié)果表明，甲基硫菌靈、殺毒礬、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢桿菌等6種藥劑對豐香和隋珠2個草莓品種根腐病的防治效果差異較大，其中，殺毒礬對豐香和隋珠的防效最佳，均為80.16%；甲基硫菌靈和枯草芽孢桿菌的防治效果也較為明顯，均分別為80.16%和69.95%。枯草芽孢桿菌的防治效果較好，且其活性成分主要為生防類芽孢桿菌，可減少農(nóng)藥使用量，降低草莓產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，可在當(dāng)?shù)卮竺娣e示范推廣應(yīng)用。