亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        山西老陳醋大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究

        2021-06-07 08:24:54張?zhí)煺?/span>孫曉琪劉丹彤王宏霞王超敏王如福
        中國食品學(xué)報(bào) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:食醋大曲菌門

        張?zhí)煺?,孫曉琪,劉丹彤,王宏霞,王超敏,王如福,許 女

        (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801)

        大曲是山西酒、醋釀造中重要的發(fā)酵劑,在山西酒、醋的發(fā)酵過程中起著非常重要的作用,直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。大曲中的微生物利用原料底物生成大量不同種類的香味物質(zhì)或香味前體物,再經(jīng)過微生物的轉(zhuǎn)化及工序傳遞,賦予成品酒、醋豐富的滋味和良好的香氣,構(gòu)成傳統(tǒng)山西酒、醋特有的風(fēng)味。

        大曲中的微生物種群主要包括霉菌、酵母菌和細(xì)菌3 大類。霉菌是大曲中最主要的菌群,其代謝產(chǎn)生豐富的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系,用于分解淀粉和蛋白質(zhì)原料產(chǎn)生多種有機(jī)酸、氨基酸、酯類等風(fēng)味物質(zhì)。酵母菌不僅利用糖生成大量乙醇和其它醇類物質(zhì),同時(shí)還生成乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯等多種酯類香氣物質(zhì)。大曲中的細(xì)菌則主要包括芽孢菌、乳酸菌和少量醋酸菌,眾多種類的細(xì)菌大大補(bǔ)充并豐富了霉菌的酶系,是產(chǎn)生有機(jī)酸、酯類、酮類、醛類等風(fēng)味物質(zhì)[1]和酚、黃酮、乙偶姻等功能活性物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)者[2]。

        近年來,一些學(xué)者對山西老陳醋大曲中的微生物進(jìn)行了分離。武晉海等[3]采用傳統(tǒng)分離手段從陳醋大曲中分離到乳酸菌、芽孢菌和醋酸菌,并且發(fā)現(xiàn)醋酸菌主要分布在大曲表面,乳酸菌和芽孢菌則主要分布在大區(qū)內(nèi)部。馮峰[4]采用傳統(tǒng)分離手段結(jié)合PCR-DGGE 技術(shù)研究大曲制備過程,發(fā)現(xiàn)前期的優(yōu)勢菌主要為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)及融合魏斯氏菌(Weissella confusa),中期優(yōu)勢菌主要為歐文氏菌(Erwinia sp.);后期則主要是芽孢桿菌(Bacillus sp.)。

        本文采用高通量測序技術(shù)研究山西老陳醋釀造用大曲的細(xì)菌群落多樣性,為揭示山西老陳醋微生物釀造機(jī)理,進(jìn)一步優(yōu)化大曲生產(chǎn)工藝,提高大曲質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。該研究對于整個(gè)老陳醋行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 樣品采集

        在山西老陳醋東湖醋廠曲房中隨機(jī)選取3 塊大曲置于滅菌的自封袋中,粉碎后混合保存于-80℃冰箱,備用。

        1.2 主要試劑與設(shè)備

        1.2.1 試劑QIAquick PCR Purification Kit,德國Qiagen 公司;Tris-平衡酚,北京索萊寶科技有限公司;乙二胺四乙酸鈉,天津市恒興試劑有限公司。

        1.2.2 設(shè)備170-4406 型水平電泳系統(tǒng)、Universial HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)、T100 型PCR 儀,美國Bio-Rad 公司;5417R 型高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf 公司;anoDrop2000 型微量紫外-可見光分光光度計(jì),美國Thermo Scientific 公司。

        1.3 宏基因組提取

        參考聶志強(qiáng)等[5]提取醋醅宏基因組的方法。提取的宏基因組用微量紫外-可見光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測,OD260/280值維持在1.8~2.0 范圍內(nèi),表明宏基因組質(zhì)量合格,可用于后續(xù)測序。

        1.4 細(xì)菌DNA 片段擴(kuò)增及Miseq 文庫建立

        以提取的宏基因組DNA 為模板,加入細(xì)菌對應(yīng)區(qū)域特異性引物(515F:5’-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3’和806R:5’-GGACTACHVGGG TWTCTAA-3’)、PCR MasterMix 對細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物送至深圳華大基因進(jìn)行文庫構(gòu)建及測序,測序平臺為MiSeq 2000。

        1.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

        將測序得到的操作分類單元(OTU)序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)采用基本局部比對搜索工具(Basic local alignment search tool,BLAST)進(jìn)行比對,搜索與目的OTU 序列同源性最高的序列,經(jīng)MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 山西老陳醋大曲細(xì)菌群落多樣性分析

        以山西老陳醋大曲宏基因組DNA 為模板,利用特異性引物對細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,采用MiSeq 2000 測序平臺進(jìn)行測序。由表1可知,大曲樣品獲得36 995 個(gè)原始讀長,濾除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后,剩余35 116 個(gè)高質(zhì)量讀長。利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對讀長拼接成32 230 個(gè)序列,平均長度為(252 ±1)bp。拼接好的序列聚類為104 個(gè)細(xì)菌OTU。最終,測序覆蓋度達(dá)到99.93%,說明該測序量合理,可以進(jìn)行下一步分析。

        表1 山西老陳醋大曲細(xì)菌OTU 劃分情況Table 1 The OTU information of the bacterial communities in the Daqu of Shanxi aged vinegar

        α-多樣性通常用于分析單個(gè)樣本中微生物數(shù)量的豐度及微生物種類的多樣性,主要包括Chao指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)。通過Mothur(v1.31.2)軟件計(jì)算微生物群落α-多樣性指數(shù)期望值并用R(v3.1.1)軟件繪制相應(yīng)的細(xì)菌α-多樣性稀釋曲線。由圖1可知,測序量在10 000 bp 以內(nèi)時(shí),隨著測序量增加,山西老陳醋大曲細(xì)菌的Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)急劇增加,當(dāng)測序量增加到25 000 bp 之后,Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)都趨于平緩。

        圖1 山西老陳醋大曲細(xì)菌α-多樣性稀釋曲線Fig.1 Alpha divisty curves of bacterial communities in the Daqu of Shanxi aged vinegar

        2.2 大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

        將OTU 序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 比對分析,采用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。從圖2和圖3結(jié)果可以看出:山西老陳醋大曲中共檢測到4 個(gè)細(xì)菌門,分別是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes),其中厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門,分別占69.67%和29.17%,放線菌門及擬桿菌門僅占0.86%和0.28%。

        如圖2所示,厚壁菌門上僅檢測到桿菌綱(Bacilli),包括的菌屬主要是:乳桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和科克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia),相對豐度分別為32.82%,29.45%,2.13%,1.65%,1.01%,0.65%和0.09%。

        乳酸菌是大曲和食醋釀造過程中的主要優(yōu)勢細(xì)菌[6],其代謝產(chǎn)生的乳酸等不揮發(fā)性酸可以降低食醋中醋酸的刺激性氣味,改善食醋風(fēng)味,賦予山西老陳醋綿酸醇柔的特點(diǎn)。另外,乳酸菌除產(chǎn)酸外,還可以產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì),在整個(gè)釀造過程中起到抑制雜菌、凈化、保持、改善釀醋微生態(tài)環(huán)境的作用。乳酸菌產(chǎn)生的γ-氨基丁酸(GABA)是近年來揭示的傳統(tǒng)谷物醋中重要功能成分之一。

        圖2表明山西老陳醋大曲中的乳酸菌菌群主要是乳桿菌屬。其中,OTU3 與瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)B1-3 相似度達(dá)99%。高亦豹等[7]在江蘇白酒大曲中也檢測到瑞士乳桿菌。李巖等[8]則從永春老醋發(fā)酵過程樣品中篩選出具有較高耐酸性的瑞士乳桿菌YCL-5,并將其應(yīng)用于葡萄醋的靜置液態(tài)發(fā)酵中,用于改善葡萄醋的發(fā)酵風(fēng)味。OTU33 與短乳桿菌(Lactobacillus brevis)SKB1023 相似度達(dá)99%。相似地,劉雄等[9]和吳林寰[10]在釀醋大曲和鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過程中也檢測到短乳桿菌的存在,并推測短乳桿菌可能是食醋重要功能活性成分——川芎嗪的前體乙偶姻的主要產(chǎn)生菌株。OTU10 與耐酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)OJC01 相似度為99%,此菌種最初是由Entani 等[11]在米醋釀造過程中檢測到的,該菌能夠以葡萄糖、果糖、甘露糖等多種碳源為底物進(jìn)行發(fā)酵,代謝產(chǎn)物主要為醋酸和乳酸。張榮展等[12]采用PCR-DGGE 法也證實(shí)了耐酸乳桿菌在天津獨(dú)流老醋釀造中的存在,由于其具有較強(qiáng)的耐酸性,因此是發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌群。OTU15 與橋乳桿菌(Lactobacillus pontis)HBUAS52247 同源性達(dá)99%。橋乳桿菌最初是在開菲爾粒中被發(fā)現(xiàn)[13],是典型的異型乳酸發(fā)酵菌株,能發(fā)酵己糖產(chǎn)生乳酸、乙醇和二氧化碳。姚粟等[14]和高亦豹等[7]分別在芝麻香型白酒大曲和江蘇白酒大曲中檢測到橋乳桿菌。橋乳桿菌也在發(fā)酵酸面團(tuán)[15]和發(fā)酵豆乳清[16]等其它發(fā)酵食品中被檢測到。

        除乳桿菌屬外,魏斯氏菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬也是乳酸菌的重要菌屬。OTU53 和OTU2分別與綠色魏斯氏菌(Weissella viridescens)FB077 和融合魏斯氏菌HBUAS54389 相似度最高(100%)。魏斯氏菌屬具有很強(qiáng)的產(chǎn)β-葡糖苷酶的能力,能夠參與發(fā)酵底物中纖維素的降解[17],另外,具有產(chǎn)乳酸、產(chǎn)胞外多糖、產(chǎn)抑菌物質(zhì)等特性,近年來在食品發(fā)酵工業(yè)中開始受到關(guān)注。與本文研究結(jié)果相似,Nie 等[18]利用PCR-DGGE 技術(shù)在山西老陳醋大曲和酒醪中檢測到綠色魏斯氏菌和融合魏斯氏菌。孫峰宇[19]則從食醋酒醅中分離純化到1 株微小魏斯氏菌(W.minor),并將其與酵母菌進(jìn)行協(xié)同醋酸發(fā)酵,最終使醋醅中的乳酸含量提高了2.10 倍,檸檬酸含量提高了4.5 倍,酯類含量提高了10%,有效改善了液態(tài)釀造食醋的風(fēng)味。OTU11 與乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)C1-36-L4a 相似性達(dá)100%。L ü等[20]和葉光斌等[21]在瀘州老窖高溫大曲和武夷紅曲糯米酒發(fā)酵液中也檢測到了乳酸片球菌。本文還檢測到假腸膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)的存在。明串珠菌屬是典型的異型乳酸發(fā)酵菌株,能發(fā)酵糖類產(chǎn)生多種酸和醇,還能代謝檸檬酸產(chǎn)生風(fēng)味成分雙乙酰[22],具有抗氧化和拮抗致病菌等能力,常用于發(fā)酵乳制品、泡菜和果酒中。劉蕓雅等[23]對紹興黃酒麥曲的研究發(fā)現(xiàn),明串珠菌屬在麥曲制備后期逐漸增加,并和乳桿菌屬協(xié)同分泌乳酸,從而為酵母菌的生長繁殖提供適宜的酸性環(huán)境。焦玉雙等[24]將假腸膜明串珠菌L18 強(qiáng)化應(yīng)用在老陳醋發(fā)酵中,最終使新淋醋中不揮發(fā)酸含量得到顯著提高。

        圖2結(jié)果顯示,OTU97 與OTU4 分別與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SXKF16-5 和HYM25 相似度達(dá)到99%,OTU7 和OTU23 則與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)KW55P和SS1 的相似度達(dá)99%和100%。研究表明,解淀粉芽孢桿菌為醬香型白酒大曲中的優(yōu)勢細(xì)菌,在大曲制備過程中人為接種地衣芽孢桿菌后,顯著提升了大曲的淀粉酶活性和醬香型大曲典型風(fēng)味物質(zhì)——己酸乙酯的含量。另外,吳林寰[10]采用宏基因測序揭示芽孢桿菌能以己糖為碳源生成乙偶姻,乙偶姻累積到一定程度后與重要中間代謝產(chǎn)物異硫氰酸酯(C5H9NS)反應(yīng),環(huán)化、脫羧、脫硫后可生成食醋重要功能活性成分——川芎嗪,故芽孢桿菌是提升食醋營養(yǎng)功能價(jià)值的重要菌種。

        高溫放線菌(Thermoactinomyces sp.)具有明顯的嗜高溫特性,常見于自然界的高溫場所,如堆肥、稻草、蔗渣等,具有產(chǎn)細(xì)胞溶解酶、嗜熱淀粉酶和新普魯蘭的功能,是研究嗜熱酶的重要微生物[14]。近年來,一些學(xué)者相繼從多種類型大曲中發(fā)現(xiàn)了高溫放線菌的存在。葉光斌等[21]通過構(gòu)建瀘州老窖高溫大曲細(xì)菌16S rRNA 基因克隆文庫,檢測到普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)及高溫放線菌。相似地,葛媛媛等[25]也從芝麻香型白酒大曲中分離到1 株普通高溫放線菌,研究證實(shí)其具有嗜高溫、產(chǎn)堿性磷酸鹽酶、酯酶、類酯酶等特性。本文首次在山西老陳醋大曲中檢測到高溫放線菌,關(guān)于其在食醋大曲和釀造中的作用機(jī)制及開發(fā)利用尚待進(jìn)一步研究。

        OTU28 與血液克羅彭斯特菌(Kroppenstedtia sanguinis)X0394 相似性達(dá)100%。姚粟等[14]采用構(gòu)建16S rDNA 克隆文庫的方法研究芝麻香型白酒高溫大曲的細(xì)菌群落,發(fā)現(xiàn)克羅彭斯特菌是大曲中的第2 優(yōu)勢菌屬,其發(fā)現(xiàn)的象牙色克羅彭斯特菌(Kroppenstedtia eburnea)屬首次報(bào)道,目前尚未有關(guān)于其功能的研究報(bào)導(dǎo)。劉延波等[26]利用高通量測序技術(shù)在濃香型白酒大曲中也檢測到克羅彭斯特菌(Kroppenstedtia),并證實(shí)此菌種由于不耐高溫,在大曲制備后期豐度顯著下降。

        非厚壁菌門細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示,變形菌門的γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria),檢測到的菌屬包括泛菌屬(Pantoea)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),分別占27.36%和0.80%。

        泛菌屬是常見的植物內(nèi)生菌,具有很強(qiáng)的固氮活性和促生作用,能以木質(zhì)素為碳源,代謝生成醇類物質(zhì),其次級代謝產(chǎn)物具有廣譜抗菌活性[27]。本文檢測到的泛菌屬的菌種主要是成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans,OTU5)、彩花泛菌(Pantoea anthophila,OTU49)和布氏泛菌(Pantoea cypripedii,OTU59),可能來源于制曲的原料大麥或豌豆中。泛菌屬產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可能在長達(dá)21 d 的制曲和3~6 個(gè)月的大曲成熟和儲存期間起著抑制雜菌的作用。Li 等[28]研究發(fā)現(xiàn),泛菌屬具有編碼β-葡萄糖苷酶的基因,除分解底物中的纖維素類物質(zhì)外,還參與形成烯萜類化合物,可賦予食醋果香及酯香等風(fēng)味。另外,成團(tuán)泛菌還能發(fā)酵D-葡萄糖和其它糖類產(chǎn)生有機(jī)酸,提升食醋中不揮發(fā)性酸的含量。

        圖2 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的山西老陳醋大曲細(xì)菌厚壁菌門系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences of Firmicutes clone libraries from the Daqu of Shanxi aged vinegar

        檢測到的不動(dòng)桿菌主要是約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter johnsonii,OTU29)和不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.,OTU37 和OTU48)。王曉丹等[29]研究證實(shí)不動(dòng)桿菌屬是遵義地區(qū)醬香型大曲重要細(xì)菌類群之一,可分泌重要的生物活性物質(zhì),如抗生素、酶和維生素,還能產(chǎn)生磷脂和葉黃素[30]等功能活性物質(zhì)。

        放線菌門上主要檢測到直桿糖多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula,OTU8 和OTU12)和霍爾迪糖多孢菌(Saccharopolyspora hordei,OTU38)。相似地Nie 等[18]和Li 等[28]也曾采用DGGE 技術(shù)在山西老陳醋大曲中檢測到直桿糖多孢菌的存在,并證實(shí)此類菌屬能代謝糖類生成揮發(fā)性脂肪酸。除食醋生產(chǎn)大曲外,白酒大曲中也有發(fā)現(xiàn)糖多孢菌屬菌群的報(bào)道,研究表明其可產(chǎn)生抗腫瘤抗生素、多種酶類、酶抑制劑等多種生物活性物質(zhì)[31]。

        本文首次在食醋大曲中檢測到北黃黃桿菌(Flavobacterium beibuense,OTU31)的存在。關(guān)于黃桿菌屬,是1923年由Bergey 首次從海洋沉積物中分離并命名的[32],目前已包含60 多種模式菌株,關(guān)于其在大曲中存在的作用和意義,今后需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

        3 結(jié)論

        本文主要采用高通量測序技術(shù)揭示山西老陳醋大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),證明厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門。芽孢菌屬、乳桿菌屬和泛菌屬為主要的優(yōu)勢菌屬,其中與瑞士乳桿菌、短乳桿菌、耐酸乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和成團(tuán)泛菌等具有很高的相似性。菌群結(jié)構(gòu)的揭示,為解析山西老陳醋微生物釀造機(jī)理、強(qiáng)化菌種制曲、大曲制備工藝革新等奠定了基礎(chǔ),對傳統(tǒng)山西老陳醋的現(xiàn)代生物技術(shù)創(chuàng)新提升,產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型、升級具有重要意義。

        猜你喜歡
        食醋大曲菌門
        關(guān)于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食醋》(GB 2719—2018)的探討
        兩宋大曲異同考
        戲曲研究(2020年2期)2020-11-16 01:21:10
        野生樹鼩與人工飼養(yǎng)樹鼩消化道不同部位微生物組成的比較研究
        唐雅樂大曲存辭考略
        中華戲曲(2020年1期)2020-02-12 02:28:10
        饑餓與重?cái)z食對河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響
        昆蟲體內(nèi)微生物多樣性的影響因素研究進(jìn)展
        妊娠期糖尿病腸道菌群變化及臨床價(jià)值分析
        食醋與人類生活
        貴州大曲
        遵義(2017年1期)2017-07-12 17:57:38
        貴州大曲
        遵義(2017年5期)2017-07-05 13:50:16
        中文字幕无线码一区二区| 亚洲av色香蕉一区二区蜜桃| 国产女主播大秀在线观看| 日本av在线一区二区| 国产成人亚洲精品青草天美| 91av手机在线观看| 久久精品国产亚洲av热一区| 97青草超碰久久国内精品91| 国产精品9999久久久久仙踪林| 亚洲日韩国产精品第一页一区| 国产自精品在线| 狼人精品剧情av在线观看| 日韩av午夜在线观看| 日韩精品人妻系列无码专区免费| 无码国产精品色午夜| 男女视频一区二区三区在线观看| 放荡的少妇2欧美版| 国产偷国产偷亚洲清高| 91亚洲色图在线观看| 一区二区三区日本伦理| 亚瑟国产精品久久| 国产欧美久久久另类精品| 亚洲图文一区二区三区四区| 欧美熟妇另类久久久久久多毛| 国产成人免费一区二区三区| 日本高清一区二区不卡视频| 成年人视频在线观看麻豆| 国内最真实的xxxx人伦| 少妇的丰满3中文字幕| 美女黄网站永久免费观看网站| 人妻久久一区二区三区蜜桃| 双腿张开被9个男人调教| 天天草夜夜草| 偷拍视频这里只有精品| 国内精品久久久久久久97牛牛| 人人狠狠综合久久亚洲婷婷| 日韩精品极品视频在线观看蜜桃| 国产日本精品一二三四区| 国产精品久久久久av福利动漫| 成人午夜免费福利| 亚洲中文字幕精品视频|