張?zhí)煺?，孫曉琪，劉丹彤，王宏霞，王超敏，王如福，許 女

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801）

大曲是山西酒、醋釀造中重要的發(fā)酵劑，在山西酒、醋的發(fā)酵過程中起著非常重要的作用，直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。大曲中的微生物利用原料底物生成大量不同種類的香味物質(zhì)或香味前體物，再經(jīng)過微生物的轉(zhuǎn)化及工序傳遞，賦予成品酒、醋豐富的滋味和良好的香氣，構(gòu)成傳統(tǒng)山西酒、醋特有的風(fēng)味。

大曲中的微生物種群主要包括霉菌、酵母菌和細(xì)菌3 大類。霉菌是大曲中最主要的菌群，其代謝產(chǎn)生豐富的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系，用于分解淀粉和蛋白質(zhì)原料產(chǎn)生多種有機(jī)酸、氨基酸、酯類等風(fēng)味物質(zhì)。酵母菌不僅利用糖生成大量乙醇和其它醇類物質(zhì)，同時(shí)還生成乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯等多種酯類香氣物質(zhì)。大曲中的細(xì)菌則主要包括芽孢菌、乳酸菌和少量醋酸菌，眾多種類的細(xì)菌大大補(bǔ)充并豐富了霉菌的酶系，是產(chǎn)生有機(jī)酸、酯類、酮類、醛類等風(fēng)味物質(zhì)[1]和酚、黃酮、乙偶姻等功能活性物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)者[2]。

近年來，一些學(xué)者對山西老陳醋大曲中的微生物進(jìn)行了分離。武晉海等[3]采用傳統(tǒng)分離手段從陳醋大曲中分離到乳酸菌、芽孢菌和醋酸菌，并且發(fā)現(xiàn)醋酸菌主要分布在大曲表面，乳酸菌和芽孢菌則主要分布在大區(qū)內(nèi)部。馮峰[4]采用傳統(tǒng)分離手段結(jié)合PCR-DGGE 技術(shù)研究大曲制備過程，發(fā)現(xiàn)前期的優(yōu)勢菌主要為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）及融合魏斯氏菌（Weissella confusa），中期優(yōu)勢菌主要為歐文氏菌（Erwinia sp.）；后期則主要是芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

本文采用高通量測序技術(shù)研究山西老陳醋釀造用大曲的細(xì)菌群落多樣性，為揭示山西老陳醋微生物釀造機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化大曲生產(chǎn)工藝，提高大曲質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。該研究對于整個(gè)老陳醋行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在山西老陳醋東湖醋廠曲房中隨機(jī)選取3 塊大曲置于滅菌的自封袋中，粉碎后混合保存于-80℃冰箱，備用。

1.2 主要試劑與設(shè)備

1.2.1 試劑QIAquick PCR Purification Kit，德國Qiagen 公司；Tris-平衡酚，北京索萊寶科技有限公司；乙二胺四乙酸鈉，天津市恒興試劑有限公司。

1.2.2 設(shè)備170-4406 型水平電泳系統(tǒng)、Universial HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)、T100 型PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；5417R 型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；anoDrop2000 型微量紫外-可見光分光光度計(jì)，美國Thermo Scientific 公司。

1.3 宏基因組提取

參考聶志強(qiáng)等[5]提取醋醅宏基因組的方法。提取的宏基因組用微量紫外-可見光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，OD260/280值維持在1.8～2.0 范圍內(nèi)，表明宏基因組質(zhì)量合格，可用于后續(xù)測序。

1.4 細(xì)菌DNA 片段擴(kuò)增及Miseq 文庫建立

以提取的宏基因組DNA 為模板，加入細(xì)菌對應(yīng)區(qū)域特異性引物（515F：5’-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGG TWTCTAA-3’）、PCR MasterMix 對細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至深圳華大基因進(jìn)行文庫構(gòu)建及測序，測序平臺為MiSeq 2000。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

將測序得到的操作分類單元（OTU）序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）采用基本局部比對搜索工具（Basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行比對，搜索與目的OTU 序列同源性最高的序列，經(jīng)MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 山西老陳醋大曲細(xì)菌群落多樣性分析

以山西老陳醋大曲宏基因組DNA 為模板，利用特異性引物對細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，采用MiSeq 2000 測序平臺進(jìn)行測序。由表1可知，大曲樣品獲得36 995 個(gè)原始讀長，濾除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，剩余35 116 個(gè)高質(zhì)量讀長。利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對讀長拼接成32 230 個(gè)序列，平均長度為（252 ±1）bp。拼接好的序列聚類為104 個(gè)細(xì)菌OTU。最終，測序覆蓋度達(dá)到99.93%，說明該測序量合理，可以進(jìn)行下一步分析。

表1 山西老陳醋大曲細(xì)菌OTU 劃分情況Table 1 The OTU information of the bacterial communities in the Daqu of Shanxi aged vinegar

α-多樣性通常用于分析單個(gè)樣本中微生物數(shù)量的豐度及微生物種類的多樣性，主要包括Chao指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)。通過Mothur（v1.31.2）軟件計(jì)算微生物群落α-多樣性指數(shù)期望值并用R（v3.1.1）軟件繪制相應(yīng)的細(xì)菌α-多樣性稀釋曲線。由圖1可知，測序量在10 000 bp 以內(nèi)時(shí)，隨著測序量增加，山西老陳醋大曲細(xì)菌的Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)急劇增加，當(dāng)測序量增加到25 000 bp 之后，Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)都趨于平緩。

圖1 山西老陳醋大曲細(xì)菌α-多樣性稀釋曲線Fig.1 Alpha divisty curves of bacterial communities in the Daqu of Shanxi aged vinegar

2.2 大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

將OTU 序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 比對分析，采用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。從圖2和圖3結(jié)果可以看出：山西老陳醋大曲中共檢測到4 個(gè)細(xì)菌門，分別是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門，分別占69.67%和29.17%，放線菌門及擬桿菌門僅占0.86%和0.28%。

如圖2所示，厚壁菌門上僅檢測到桿菌綱（Bacilli），包括的菌屬主要是：乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和科克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia），相對豐度分別為32.82%，29.45%，2.13%，1.65%，1.01%，0.65%和0.09%。

乳酸菌是大曲和食醋釀造過程中的主要優(yōu)勢細(xì)菌[6]，其代謝產(chǎn)生的乳酸等不揮發(fā)性酸可以降低食醋中醋酸的刺激性氣味，改善食醋風(fēng)味，賦予山西老陳醋綿酸醇柔的特點(diǎn)。另外，乳酸菌除產(chǎn)酸外，還可以產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，在整個(gè)釀造過程中起到抑制雜菌、凈化、保持、改善釀醋微生態(tài)環(huán)境的作用。乳酸菌產(chǎn)生的γ-氨基丁酸（GABA）是近年來揭示的傳統(tǒng)谷物醋中重要功能成分之一。

圖2表明山西老陳醋大曲中的乳酸菌菌群主要是乳桿菌屬。其中，OTU3 與瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）B1-3 相似度達(dá)99%。高亦豹等[7]在江蘇白酒大曲中也檢測到瑞士乳桿菌。李巖等[8]則從永春老醋發(fā)酵過程樣品中篩選出具有較高耐酸性的瑞士乳桿菌YCL-5，并將其應(yīng)用于葡萄醋的靜置液態(tài)發(fā)酵中，用于改善葡萄醋的發(fā)酵風(fēng)味。OTU33 與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）SKB1023 相似度達(dá)99%。相似地，劉雄等[9]和吳林寰[10]在釀醋大曲和鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過程中也檢測到短乳桿菌的存在，并推測短乳桿菌可能是食醋重要功能活性成分——川芎嗪的前體乙偶姻的主要產(chǎn)生菌株。OTU10 與耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）OJC01 相似度為99%，此菌種最初是由Entani 等[11]在米醋釀造過程中檢測到的，該菌能夠以葡萄糖、果糖、甘露糖等多種碳源為底物進(jìn)行發(fā)酵，代謝產(chǎn)物主要為醋酸和乳酸。張榮展等[12]采用PCR-DGGE 法也證實(shí)了耐酸乳桿菌在天津獨(dú)流老醋釀造中的存在，由于其具有較強(qiáng)的耐酸性，因此是發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌群。OTU15 與橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）HBUAS52247 同源性達(dá)99%。橋乳桿菌最初是在開菲爾粒中被發(fā)現(xiàn)[13]，是典型的異型乳酸發(fā)酵菌株，能發(fā)酵己糖產(chǎn)生乳酸、乙醇和二氧化碳。姚粟等[14]和高亦豹等[7]分別在芝麻香型白酒大曲和江蘇白酒大曲中檢測到橋乳桿菌。橋乳桿菌也在發(fā)酵酸面團(tuán)[15]和發(fā)酵豆乳清[16]等其它發(fā)酵食品中被檢測到。

除乳桿菌屬外，魏斯氏菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬也是乳酸菌的重要菌屬。OTU53 和OTU2分別與綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens）FB077 和融合魏斯氏菌HBUAS54389 相似度最高（100%）。魏斯氏菌屬具有很強(qiáng)的產(chǎn)β-葡糖苷酶的能力，能夠參與發(fā)酵底物中纖維素的降解[17]，另外，具有產(chǎn)乳酸、產(chǎn)胞外多糖、產(chǎn)抑菌物質(zhì)等特性，近年來在食品發(fā)酵工業(yè)中開始受到關(guān)注。與本文研究結(jié)果相似，Nie 等[18]利用PCR-DGGE 技術(shù)在山西老陳醋大曲和酒醪中檢測到綠色魏斯氏菌和融合魏斯氏菌。孫峰宇[19]則從食醋酒醅中分離純化到1 株微小魏斯氏菌（W.minor），并將其與酵母菌進(jìn)行協(xié)同醋酸發(fā)酵，最終使醋醅中的乳酸含量提高了2.10 倍，檸檬酸含量提高了4.5 倍，酯類含量提高了10%，有效改善了液態(tài)釀造食醋的風(fēng)味。OTU11 與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）C1-36-L4a 相似性達(dá)100%。L ü等[20]和葉光斌等[21]在瀘州老窖高溫大曲和武夷紅曲糯米酒發(fā)酵液中也檢測到了乳酸片球菌。本文還檢測到假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）的存在。明串珠菌屬是典型的異型乳酸發(fā)酵菌株，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生多種酸和醇，還能代謝檸檬酸產(chǎn)生風(fēng)味成分雙乙酰[22]，具有抗氧化和拮抗致病菌等能力，常用于發(fā)酵乳制品、泡菜和果酒中。劉蕓雅等[23]對紹興黃酒麥曲的研究發(fā)現(xiàn)，明串珠菌屬在麥曲制備后期逐漸增加，并和乳桿菌屬協(xié)同分泌乳酸，從而為酵母菌的生長繁殖提供適宜的酸性環(huán)境。焦玉雙等[24]將假腸膜明串珠菌L18 強(qiáng)化應(yīng)用在老陳醋發(fā)酵中，最終使新淋醋中不揮發(fā)酸含量得到顯著提高。

圖2結(jié)果顯示，OTU97 與OTU4 分別與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）SXKF16-5 和HYM25 相似度達(dá)到99%，OTU7 和OTU23 則與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）KW55P和SS1 的相似度達(dá)99%和100%。研究表明，解淀粉芽孢桿菌為醬香型白酒大曲中的優(yōu)勢細(xì)菌，在大曲制備過程中人為接種地衣芽孢桿菌后，顯著提升了大曲的淀粉酶活性和醬香型大曲典型風(fēng)味物質(zhì)——己酸乙酯的含量。另外，吳林寰[10]采用宏基因測序揭示芽孢桿菌能以己糖為碳源生成乙偶姻，乙偶姻累積到一定程度后與重要中間代謝產(chǎn)物異硫氰酸酯（C5H9NS）反應(yīng)，環(huán)化、脫羧、脫硫后可生成食醋重要功能活性成分——川芎嗪，故芽孢桿菌是提升食醋營養(yǎng)功能價(jià)值的重要菌種。

高溫放線菌（Thermoactinomyces sp.）具有明顯的嗜高溫特性，常見于自然界的高溫場所，如堆肥、稻草、蔗渣等，具有產(chǎn)細(xì)胞溶解酶、嗜熱淀粉酶和新普魯蘭的功能，是研究嗜熱酶的重要微生物[14]。近年來，一些學(xué)者相繼從多種類型大曲中發(fā)現(xiàn)了高溫放線菌的存在。葉光斌等[21]通過構(gòu)建瀘州老窖高溫大曲細(xì)菌16S rRNA 基因克隆文庫，檢測到普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）及高溫放線菌。相似地，葛媛媛等[25]也從芝麻香型白酒大曲中分離到1 株普通高溫放線菌，研究證實(shí)其具有嗜高溫、產(chǎn)堿性磷酸鹽酶、酯酶、類酯酶等特性。本文首次在山西老陳醋大曲中檢測到高溫放線菌，關(guān)于其在食醋大曲和釀造中的作用機(jī)制及開發(fā)利用尚待進(jìn)一步研究。

OTU28 與血液克羅彭斯特菌（Kroppenstedtia sanguinis）X0394 相似性達(dá)100%。姚粟等[14]采用構(gòu)建16S rDNA 克隆文庫的方法研究芝麻香型白酒高溫大曲的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)克羅彭斯特菌是大曲中的第2 優(yōu)勢菌屬，其發(fā)現(xiàn)的象牙色克羅彭斯特菌（Kroppenstedtia eburnea）屬首次報(bào)道，目前尚未有關(guān)于其功能的研究報(bào)導(dǎo)。劉延波等[26]利用高通量測序技術(shù)在濃香型白酒大曲中也檢測到克羅彭斯特菌（Kroppenstedtia），并證實(shí)此菌種由于不耐高溫，在大曲制備后期豐度顯著下降。

非厚壁菌門細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，變形菌門的γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），檢測到的菌屬包括泛菌屬（Pantoea）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），分別占27.36%和0.80%。

泛菌屬是常見的植物內(nèi)生菌，具有很強(qiáng)的固氮活性和促生作用，能以木質(zhì)素為碳源，代謝生成醇類物質(zhì)，其次級代謝產(chǎn)物具有廣譜抗菌活性[27]。本文檢測到的泛菌屬的菌種主要是成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans，OTU5）、彩花泛菌（Pantoea anthophila，OTU49）和布氏泛菌（Pantoea cypripedii，OTU59），可能來源于制曲的原料大麥或豌豆中。泛菌屬產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可能在長達(dá)21 d 的制曲和3～6 個(gè)月的大曲成熟和儲存期間起著抑制雜菌的作用。Li 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬具有編碼β-葡萄糖苷酶的基因，除分解底物中的纖維素類物質(zhì)外，還參與形成烯萜類化合物，可賦予食醋果香及酯香等風(fēng)味。另外，成團(tuán)泛菌還能發(fā)酵D-葡萄糖和其它糖類產(chǎn)生有機(jī)酸，提升食醋中不揮發(fā)性酸的含量。

圖2 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的山西老陳醋大曲細(xì)菌厚壁菌門系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences of Firmicutes clone libraries from the Daqu of Shanxi aged vinegar

檢測到的不動(dòng)桿菌主要是約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii，OTU29）和不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.，OTU37 和OTU48）。王曉丹等[29]研究證實(shí)不動(dòng)桿菌屬是遵義地區(qū)醬香型大曲重要細(xì)菌類群之一，可分泌重要的生物活性物質(zhì)，如抗生素、酶和維生素，還能產(chǎn)生磷脂和葉黃素[30]等功能活性物質(zhì)。

放線菌門上主要檢測到直桿糖多孢菌（Saccharopolyspora rectivirgula，OTU8 和OTU12）和霍爾迪糖多孢菌（Saccharopolyspora hordei，OTU38）。相似地Nie 等[18]和Li 等[28]也曾采用DGGE 技術(shù)在山西老陳醋大曲中檢測到直桿糖多孢菌的存在，并證實(shí)此類菌屬能代謝糖類生成揮發(fā)性脂肪酸。除食醋生產(chǎn)大曲外，白酒大曲中也有發(fā)現(xiàn)糖多孢菌屬菌群的報(bào)道，研究表明其可產(chǎn)生抗腫瘤抗生素、多種酶類、酶抑制劑等多種生物活性物質(zhì)[31]。

本文首次在食醋大曲中檢測到北黃黃桿菌（Flavobacterium beibuense，OTU31）的存在。關(guān)于黃桿菌屬，是1923年由Bergey 首次從海洋沉積物中分離并命名的[32]，目前已包含60 多種模式菌株，關(guān)于其在大曲中存在的作用和意義，今后需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

本文主要采用高通量測序技術(shù)揭示山西老陳醋大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，證明厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門。芽孢菌屬、乳桿菌屬和泛菌屬為主要的優(yōu)勢菌屬，其中與瑞士乳桿菌、短乳桿菌、耐酸乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和成團(tuán)泛菌等具有很高的相似性。菌群結(jié)構(gòu)的揭示，為解析山西老陳醋微生物釀造機(jī)理、強(qiáng)化菌種制曲、大曲制備工藝革新等奠定了基礎(chǔ)，對傳統(tǒng)山西老陳醋的現(xiàn)代生物技術(shù)創(chuàng)新提升，產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型、升級具有重要意義。