楊 帥，楊永壇，穆 蕾，楊 霞，楊悠悠*，羅云敬*

（1 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院 北京100124 2 中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院 營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京102209 3 安捷倫科技有限公司 上海200131）

真菌毒素是真菌的次生代謝產(chǎn)物，真菌在一定條件下生長(zhǎng)極其迅速，不同菌種產(chǎn)生不同類(lèi)型的毒素，種類(lèi)繁多，可導(dǎo)致人和動(dòng)物急慢性中毒，對(duì)人體及動(dòng)物的健康危害極大[1]。糧食作物在收割過(guò)程中因刮傷或儲(chǔ)存條件不當(dāng)，而使真菌毒素迅速累積，造成毒素污染，其污染范圍難以控制，危害難以防控[2]。

黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、雜色曲霉素等是食用油中經(jīng)常出現(xiàn)的毒素種類(lèi)[3-5]。其中，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織列為“I 類(lèi)致癌物”，其具有親肝性，可誘發(fā)肝炎、肝硬化、甚至肝癌等惡性疾病，危害極大[6]。北京等地區(qū)食用油樣品的隨機(jī)抽取結(jié)果顯示：黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮均有較高的檢出率[7]。為保障公眾健康，世界各國(guó)均對(duì)植物油脂中的部分真菌毒素含量制定了相關(guān)規(guī)定。我國(guó)僅對(duì)食用植物油中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行了限量（見(jiàn)GB 2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》），規(guī)定要求：食用油中黃曲霉毒素B1含量不得超過(guò)10 μg/kg，其中花生油和玉米油不得超過(guò)20 μg/kg[8]。

目前，真菌毒素的檢測(cè)手段主要有高效液相色譜法（HPLC）[9-12]、酶聯(lián)免疫法[13-15]以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[16-19]。其中，酶聯(lián)免疫法具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，多用于單一真菌毒素的快速篩查，其檢測(cè)結(jié)果容易受到基質(zhì)中的油脂干擾，假陽(yáng)性高，需要通過(guò)其它手段對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證[15]。高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測(cè)器或串聯(lián)質(zhì)譜儀是目前主要的真菌毒素檢測(cè)方法，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，其前處理多數(shù)需要分別配合免疫親和柱/多功能凈化柱使用[20-22]。免疫親和凈化柱是利用抗原抗體的特異性結(jié)合達(dá)到去除基質(zhì)中干擾物質(zhì)的目的，其專(zhuān)一性和選擇性較強(qiáng)。然而，鍵合一種抗體的免疫親和凈化柱只能對(duì)單一目標(biāo)物進(jìn)行凈化，若應(yīng)用于多毒素篩查則需要對(duì)填料進(jìn)行復(fù)配，檢測(cè)成本昂貴[23-24]。多功能凈化柱可應(yīng)用于多種毒素的篩查，然而多數(shù)多功能凈化柱用離子交換填料，會(huì)吸附食用油中潛在赭曲霉毒素和伏馬毒素等酸性化合物[25]，因此不適合多類(lèi)真菌毒素的同時(shí)篩查。

基于此，本研究通過(guò)優(yōu)化提取方法以及優(yōu)選多功能凈化柱，以實(shí)現(xiàn)高效快速的樣品前處理，再結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)食用植物油中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等28 種真菌毒素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

甲醇、乙腈（色譜純級(jí)），美國(guó)Sigma 公司；甲酸（色譜純級(jí)），霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司；甲酸（98%），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（AFT B1、B2、G1和G2）、黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFTM1）、HT-2 毒素（HT-2 toxin，HT-2）、T-2 毒素（T-2 toxin，T-2）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）、伏馬毒素B1（Fumonisim B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素B2（Fumonisim B2，F(xiàn)B2）、伏馬毒素B3（Fumonisim B3，F(xiàn)B3）、嘔吐毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液【包括：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol）、3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-Acetyldeoxynivalenol，3-Ac-DON）、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-Acetyldeoxynivalenol，15-Ac-DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（Nivalenol，Niv）、3-葡萄糖苷化-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol 3-glucoside，DON-3-Glu））】，均購(gòu)自ROMER國(guó)際貿(mào)易有限公司；渥曼青霉素（Wortmannin，Wor）、赭曲霉毒素B（Ochratoxin B，OTB）、黃曲霉毒素M2（Aflatoxin M2，AFTM2），均購(gòu)自北京振翔科技有限公司；新茄病鐮刀菌烯醇（Neosolaniol，Neo）、蛇形毒素（Diacetoxyscirpenol，Dia）、雜色曲霉素（Sterigmatocysin，Ster）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone）、α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalenol，α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-Zearalenol，β-ZEL）、玉米赤霉酮（Zearalanone，ZAN）、α-玉米赤霉醇（α-zearalanol，α-ZAL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalanol，β-ZAL），均購(gòu)自上海安譜科技實(shí)驗(yàn)股份有限公司。

LC-30AD 高效液相色譜儀，日本島津公司；QTRAP 5500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)AB Sciex公司；Allegra 64R 臺(tái)式高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；Milli Q 超純水機(jī)，美國(guó)Millipore 公司；Captival EMR-Lipid 固相萃取凈化柱，美國(guó)安捷倫公司；QL902 渦旋振蕩器，德國(guó)Dragon Lab 公司；SB-3200DTDN 超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 前處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 g 食用油樣品（精確至0.01 g）于15 mL 離心管中，加入5 mL 乙腈/水/甲酸提取液（V乙腈∶V水∶V甲酸=80∶18∶2），渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min，-20℃冷凍10 min，5 000 r/min 離心10 min，取上層清液全部轉(zhuǎn)移至一潔凈試管；向樣品試管中加入5 mL 乙腈/水/甲酸提取液（V乙腈∶V水∶V甲酸=20∶78∶2），同上述步驟進(jìn)行提取，合并2次提取液并混勻，待凈化。

取5 mL 混合提取液加入Captiva EMR-Lipid凈化柱，加正壓使提取液流經(jīng)凈化柱速度為3 s/d，待提取液全部流出后，加入2 mL 乙腈/水（V乙腈∶V水=80∶20）溶液沖洗，收集全部?jī)艋蟮奶崛∫海?0℃水浴下，氮?dú)獯蹈?，加?50 μL 甲醇/水/甲酸溶液（V甲醇∶V水∶V甲酸=30∶70∶0.1）復(fù)溶，12 000 r/min 離心10 min，取上層清液待測(cè)。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Shiseido-C18（100 mm×2.0 mm，3 μm）；進(jìn)樣量20 μL；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相：A 相為0.1%甲酸/水溶液，B 相為0.1%甲酸/甲醇溶液；正模式洗脫梯度：0～1 min 30% B，6.5 min 55% B，8.5 min 55% B，10 min 80% B，12 min 80% B，12.01 min 30% B，16 min 30% B；負(fù)模式洗脫梯度為：0 min 3% B，2 min 55% B，9 min 70% B，10 min 99% B，11 min 99% B，11.1 min 3% B，15 min 3% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），離子源溫度550℃；噴霧電壓5 500 V（正模式）/-4 500 V（負(fù)模式）；氣簾氣2.4×105 Pa；氣體1 3.8×105Pa；氣體2 3.8×105Pa；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 真菌毒素的分離優(yōu)化

本研究通過(guò)洗脫梯度優(yōu)化結(jié)合串接質(zhì)譜MRM 模式，可有效避免復(fù)雜基質(zhì)對(duì)真菌毒素檢測(cè)的干擾，并獲得最優(yōu)的分離效率。通過(guò)對(duì)離子化條件、離子對(duì)的篩選以及各毒素目標(biāo)物的碎裂能和去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化（如表1所示），以期獲得最優(yōu)靈敏度。結(jié)合28 種真菌毒素目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異，分別使用正、負(fù)電離模式，其MRM 譜圖如圖1和圖2所示。

表1 28 種真菌毒素的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 28 mycotoxins

圖1 28 種真菌毒素正模式MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 28 mycotoxins of positive mode

圖2 28 種真菌毒素混標(biāo)的負(fù)模式MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 28 mycotoxins of negative mode

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限 取空白食用油樣品，按照1.2 節(jié)中方法進(jìn)行前處理，制備空白基質(zhì)提取液。向空白基質(zhì)提取液中加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)液配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.3 節(jié)中的條件進(jìn)行測(cè)定。以各毒素目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。分別計(jì)算各毒素在3 倍信噪比和10 倍信噪比響應(yīng)時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，確定方法對(duì)于各目標(biāo)物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表2。從結(jié)果可以看出，各毒素目標(biāo)物在其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性范圍滿足風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控的需求。

表2 28 種真菌毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 2 Linear relationship，correlation coefficient，limit of detections（LODs）and limit of quantifications（LOQs）of 28 mycotoxins

（續(xù)表2）

2.2.2 方法回收率及精密度 為有效避免食用油基質(zhì)對(duì)真菌毒素提取效率的影響，綜合考慮28 種真菌毒素的極性差異，采用分步提取法，使用不同有機(jī)相比例的提取液進(jìn)行提取。首先使用乙腈/水/甲酸（V乙腈∶V水∶V甲酸=80∶20∶0.1）對(duì)非極性目標(biāo)化合物（如黃曲霉毒素等）進(jìn)行提取。第2 步使用乙腈/水/甲酸（V乙腈∶V水∶V甲酸=20∶80∶0.1），對(duì)極性較大的化合物（如伏馬毒素等）進(jìn)行提取。合并提取液以提高各毒素目標(biāo)物的提取效率。

圖3對(duì)比了80%乙腈（2%甲酸）單一溶劑提取和分步提取方法對(duì)于伏馬毒素回收率的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，分步提取法對(duì)伏馬毒素回收率具有明顯的提升。

圖3 不同提取方法對(duì)于伏馬毒素回收率的影響Fig.3 Effects of different extraction methods on fumarotoxin recovery

取空白樣品提取液，進(jìn)行三水平加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)含量水平平行測(cè)定6 次，計(jì)算6 次加標(biāo)試驗(yàn)的平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），其結(jié)果見(jiàn)表3。本方法對(duì)于28 種真菌毒素的回收率在60%～120%之間，RSD 小于15%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中對(duì)于方法回收率和精密度的要求。

表3 取空白樣品提取液中28 種真菌毒素加標(biāo)回收率及穩(wěn)定性（n=6）Table 3 Spike recoveries and relative standard deviations of 28 mycotoxins in blank oils（n=6）

（續(xù)表3）

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本法，對(duì)市售的5 種常見(jiàn)食用油（玉米油、花生油、葵花籽油、大豆油、菜籽油）進(jìn)行真菌毒素的風(fēng)險(xiǎn)篩查，結(jié)果如表4所示。篩查結(jié)果顯示：雖然所測(cè)食用油樣品存在黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、雜色曲霉素、α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮的污染，但是各真菌毒素含量范圍均滿足我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中對(duì)于食用油中真菌毒素的限量要求。其次，花生油受污染的真菌毒素種類(lèi)較多，包括黃曲霉毒素B1、B2和G1、雜色曲霉毒素以及玉米赤霉烯酮，玉米油受玉米赤霉烯酮污染的范圍較大，應(yīng)給予持續(xù)關(guān)注。

表4 常見(jiàn)食用油中真菌毒素的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)Table 4 Risk screening of 28 mycotoxins in common edible oil samples

（續(xù)表4）

3 結(jié)論

通過(guò)使用不同提取試劑的分步提取法，提高了28 種真菌毒素的提取效率。使用脂質(zhì)凈化柱凈化提取液，去除了食用油基質(zhì)中脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的干擾，各真菌毒素回收率在60%～120%范圍。該樣品凈化方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)食用油基質(zhì)中多類(lèi)真菌毒素的一步凈化，相較于傳統(tǒng)方法中使用免疫親和柱和多功能凈化柱，可較大程度地降低試驗(yàn)成本。樣品經(jīng)C18 色譜柱進(jìn)行分離及外標(biāo)法定量后，重復(fù)性、檢出限、定量限和線性等指標(biāo)均可滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求。該方法具有高通量、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于食用油中多中真菌毒素的快速風(fēng)險(xiǎn)篩查。