王 溢，張 暉，陳 平，郭 微，廖柏勇

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院 廣州510225）

桑葉為?？坡淙~喬木桑樹的葉，具有抗菌、抗氧化、降血糖等藥用價值[1-2]。桑葉在中醫(yī)藥領(lǐng)域治療糖尿病、關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病等人類疾病方面具有悠久的歷史[3]。研究發(fā)現(xiàn)桑葉通過內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶信號調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)[4]。桑葉的藥用研究證明，桑葉在糖尿病治療中具有顯著的功效，可以通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3 激酶和蛋白激酶B 信號通路中的基因表達(dá)來促進糖原異生和糖原合成[5-6]。

桑葉以其富含多糖、黃酮類、多酚和生物堿等活性物質(zhì)而成為國家衛(wèi)計委公布的“藥食兩用”植物資源[7-8]。桑葉藥用成分檢測和功能分析等相關(guān)研究已從桑葉乙醇提取物中純化出桑葉多糖，并證明多糖是桑葉中的主要活性成分之一[8]。桑葉黃酮類物質(zhì)具有清除自由基的作用，桑葉乙醇提取物的抗氧化活性高于桑椹和莖提取物[9-10]。對桑葉、莖皮、果實和根皮的甲醇提取物抗氧化活性和酚含量的比較研究表明，桑葉的抗氧化活性最高[11-12]。桑葉提取物中分離的多糖、總黃酮和生物堿類物質(zhì)具有抑制糖苷酶活性的作用，生物堿類物質(zhì)降血糖效果最佳[13-14]。

隨著桑葉的藥用和保健功能被深入挖掘，桑葉菜成為一種新型健康食品[15]。桑葉鮮銷過程中易出現(xiàn)萎蔫、皺縮和發(fā)黃現(xiàn)象，品質(zhì)與營養(yǎng)難以得到保證，同時，鮮葉供應(yīng)受采摘時間和季節(jié)的限制，因此生產(chǎn)干制桑葉菜是延長保質(zhì)期和保證品質(zhì)的有效手段[15-16]。國內(nèi)生產(chǎn)桑葉菜的工藝中常采用冷凍干燥和熱風(fēng)干燥的方式，其中冷凍干燥桑葉的葉綠素、酚類和多糖保留率較高，色澤較為鮮亮，葉片組織結(jié)構(gòu)較為完整，烹飪后復(fù)水率可達(dá)93%[16]。通過掃描電鏡觀察熱風(fēng)干燥處理的桑葉，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞、錯位，導(dǎo)致細(xì)胞完整性喪失，組織結(jié)構(gòu)塌陷[16]。為在桑葉的干燥過程中更多地保留活性成分和營養(yǎng)物質(zhì)，本研究比較冷凍干燥技術(shù)與傳統(tǒng)的熱風(fēng)干燥技術(shù)對蛋白質(zhì)組分的影響，了解不同干燥技術(shù)的加工特性，為高品質(zhì)桑葉菜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器、設(shè)備

以粵椹大10 的夏季新鮮桑葉為原料，采摘頂芽以下3～5 位葉。將采摘的新鮮桑葉用去離子水沖洗5 min，濾紙吸取表面多余的水分，切成寬2 cm，長10 cm 的條形。

GHRH-100 型熱泵干燥，廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備研究所；CZ-FD-27S 真空冷凍干燥機，上海程造儀器設(shè)備有限公司；5920R 低溫離心機，德國Eppendorf 公司；Q-Exactive 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Finnigan 公司；S22 分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；PVDF 膜，美國默克公司；超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；WR0100 垂直電泳儀，美國伯樂公司。

1.2 桑葉的干燥處理

1.2.1 熱風(fēng)干燥稱取桑葉20 g 平鋪于托盤中，置于鼓風(fēng)干燥箱中干燥。干燥條件設(shè)定為60℃、1.5 h，75℃、1 h，85℃、0.75 h。將干燥后的桑葉粉碎，儲存于-80℃超低溫冰箱。

1.2.2 冷凍干燥稱取桑葉20 g 于-80℃超低溫冰箱中冷凍24 h，將桑葉樣品于真空冷凍干燥儀器中干燥24 h，溫度設(shè)置為-40℃。將干燥后的桑葉粉碎，儲存于-80℃超低溫冰箱。

1.3 蛋白提取

每個樣品稱取1 g 葉片，采用三氯乙酸-丙酮法提取6 個樣品總蛋白。熱風(fēng)干燥標(biāo)記為RF-1、RF-2 和RF-3；冷凍干燥標(biāo)記為LD-1、LD-2 和LD-3。蛋白質(zhì)提取參照文獻(xiàn)[17]和[18]的方法并作細(xì)微的調(diào)整，提取的蛋白質(zhì)濃度參照Bradford法[19]測定。

1.4 葉片蛋白質(zhì)樣品酶解

在200 μg 蛋白質(zhì)樣品中加入DTT，使最終混合溶液中DTT 濃度為100 mmol/L。100℃水浴5 min。冷卻后，混入200 μL UA 緩沖液（8 mol/L 尿素，150 mmol/L Tris‐HCl pH 8.0）。將混合樣品轉(zhuǎn)移至30 ku 超濾離心管中，11 000 r/min 離心20 min。混入200 μL UA 緩沖液重復(fù)離心，去濾液；加入100 μL 含有50 mmol/L IAA 的UA 緩沖液，振蕩1 min。室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min，隨后11 000 r/min 離心20 min，重復(fù)此步驟2 次。加100 μL 碳酸氫銨緩沖液，以11 000 r/min 離心20 min，并重復(fù)此操作兩次。加入40 μL 胰酶緩沖液，充分振蕩，在37℃條件下酶解16～18 h。用新的無菌收集管收集離心后（11 000 r/min，20 min）的濾液，除鹽后測量波長280 nm 處的OD 值。

1.5 LC-MS/MS 分析

根據(jù)酶解產(chǎn)物的濃度，從各樣品酶解產(chǎn)物中取2 μg 上樣。樣品酶解產(chǎn)物通過毛細(xì)管高效液相色譜分離。分離梯度：0～100 min，B 液線性梯度從0%到45%；100～108 min，B 液線性梯度從45%到100%；108～120 min，B 液維持在100%。采用QExactive 質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。

1.6 Maxquant 非標(biāo)記分析

將桑葉蛋白樣品LC-MS/MS 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Maxquant 軟件（版本號1.3.0.5）進行數(shù)據(jù)庫搜索，對各組原始數(shù)據(jù)進行鑒定和相對表達(dá)量的比較。本研究用數(shù)據(jù)庫為mulberry_173773_20160518.fasta。

1.7 差異蛋白篩選及生物信息學(xué)分析

以冷凍干燥的蛋白質(zhì)樣品為對照，將熱風(fēng)干燥處理的蛋白質(zhì)樣品質(zhì)譜非標(biāo)記定量強度與冷凍干燥的蛋白質(zhì)樣品比較，以3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值作為蛋白表達(dá)的差異倍率，兩種干燥方式的差異蛋白篩選條件為P 值小于0.05，上、下調(diào)差異倍數(shù)在1.2 倍以上。如上、下調(diào)差異倍數(shù)小于1.2則認(rèn)為該蛋白質(zhì)表達(dá)量無差異。采用GO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneo-ntology.org/）和KEGG 通路數(shù)據(jù) 庫（http：//www.genome.ad.jp/kegg/）對差異蛋白進行GO 功能注釋和參與的代謝通路分析，獲得差異蛋白質(zhì)的分子功能、生物過程以及細(xì)胞組分等信息。

1.8 免疫印跡驗證

將蛋白質(zhì)組非標(biāo)記定量分析中提取的蛋白質(zhì)樣品用于免疫印跡驗證。將6 個樣本蛋白質(zhì)樣品在濃縮膠電壓80 V、分離膠電壓120 V 條件下采用SDS-PAGE 方法分離。隨后，將分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，300 mA 電泳1 h。吸附有蛋白樣品的PVDF 膜在TBS-T 溶液【0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.6），1.37 mol/L NaCl，0.1% Tween20】中洗5 min。清洗后的PVDF 膜在5% BSA 溶液（5 g BSA 溶于100 mL TBS-T 溶液）中封閉1 h，TBS-T 清洗5 min 后轉(zhuǎn)入相應(yīng)一抗中，室溫震蕩1～2 h。用TBS-T 清洗3 次，每次5 min，轉(zhuǎn)入二抗中，室溫震蕩1 h。TBS-T 清洗后用超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進行反應(yīng)，采用X 光片檢測信號。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Protein Pilot 5.0 軟件在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫檢索，報告置信度在95%以上的蛋白質(zhì)共4 292 個，差異蛋白為114 個，其中上調(diào)差異蛋白62 個，下調(diào)差異蛋白52 個。分析鑒定的蛋白質(zhì)分布的理化性質(zhì)，蛋白分子質(zhì)量范圍1.3～566.4 ku，等電點范圍3.9～12.4（圖1）。

圖1 鑒定出的蛋白質(zhì)等電點和分子質(zhì)量分布Fig.1 Protein isoelectric point and mass distribution analysis of identified proteins

2.2 桑葉菜總蛋白質(zhì)功能分類

本研究中，通過label-free 方法從兩種加工方式的桑葉中鑒定出的總蛋白數(shù)為4 292 個。根據(jù)這些蛋白質(zhì)的功能分類，涵蓋了11 種分子功能，包括細(xì)胞發(fā)育過程（7%）、細(xì)胞質(zhì)（2%）、能量代謝（10%）、細(xì)胞膜和物質(zhì)轉(zhuǎn)運（4%）、代謝過程（11%）、光合作用（13%）、蛋白質(zhì)折疊轉(zhuǎn)運和降解（2%）、蛋白質(zhì)合成（7%）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（6%）和壓力與防御（8%）（圖2）。

圖2 桑葉菜中鑒定的蛋白質(zhì)功能分類Fig.2 Function classification of proteins identified in mulberry leaf vegetable

2.3 桑葉菜加工工藝對其蛋白質(zhì)組分的影響

熱風(fēng)干燥與冷凍干燥的蛋白質(zhì)組檢測分別做3 次生物學(xué)重復(fù)，與冷凍干燥處理組相比，熱風(fēng)干燥處理的桑葉顯著變化的蛋白質(zhì)數(shù)量為114 個（表1）。以冷凍干燥處理組為對照，熱風(fēng)干燥處理的桑葉菜中62 個蛋白質(zhì)含量下降，多于冷凍干燥處理方式。參照前人的研究[20-21]，對篩選出的差異蛋白質(zhì)采用Cluster 聚類分析，將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在不同樣品中表達(dá)量的對數(shù)值以不同顏色在熱圖中展現(xiàn)（圖3），聚類分析結(jié)果顯示組內(nèi)樣本重復(fù)性較好。

表1 兩種干燥方式的桑葉差異蛋白質(zhì)列表Table 1 Differential proteins lists in mulberry leaves between two drying methods

2.4 桑葉菜差異蛋白質(zhì)功能注釋與分類

對兩種加工方式的桑葉菜中篩選出的114 個差異蛋白質(zhì)進行功能注釋與分類。按照生物過程（Biological Process）、分 子 功 能（Molecular Function）和細(xì)胞組分（Cellular Component）將114 個差異蛋白質(zhì)分為25 類，其中參與生物過程所占比例較高的前5 個是代謝過程（31.3%）、細(xì)胞過程（29.7%）、刺激響應(yīng)（8.7%）、光合作用（3.9%）和生物合成過程調(diào)控（3.1%）；分子功能類別中所占比例較高的前5 個是催化活性占40.9%，蛋白質(zhì)結(jié)合占32.9%，載體活性占3.5%，分子結(jié)構(gòu)活性占3.3%，分子功能調(diào)節(jié)劑占3.1%。

2.5 免疫印跡驗證

為了驗證非標(biāo)記定量蛋白鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用與非標(biāo)記定量分析相同的蛋白樣品進行免疫印跡驗證分析。以新鮮桑葉的蛋白質(zhì)樣品為對照，選取葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-葡糖苷酶（W9RMX9，Glucan endo-1，3-beta-glucosidase）為目標(biāo)蛋白，做免疫印跡分析。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)W9RMX9 的免疫印跡結(jié)果與非標(biāo)記定量結(jié)果一致，表明非標(biāo)記定量方法的可靠性，能夠真實反映蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的變化情況。

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

3 討論

本研究中鑒定肽段數(shù)為28 902，特異性肽段覆蓋率為63.4%，特異性肽段匹配率高顯示了非標(biāo)記定量技術(shù)的靈敏性與準(zhǔn)確性[21]。此外，鑒定出的蛋白質(zhì)等電點（pI）介于3.9～12.4 之間，分子質(zhì)量介于1.3～566.4 ku 范圍，表明非標(biāo)記定量技術(shù)不僅可以檢測出極酸、極堿等極性蛋白質(zhì)，還能夠鑒定分子質(zhì)量小于10 ku 或超大的蛋白質(zhì)分子。采用免疫印跡法驗證蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示免疫印跡結(jié)果與蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量結(jié)果一致，表明非標(biāo)記定量方法應(yīng)用于食品蛋白質(zhì)組檢測的可靠性。

桑葉加工會破壞葉片組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)降解。不同的干燥方法對桑葉菜品質(zhì)的影響不同。從冷凍干燥的產(chǎn)品微觀結(jié)構(gòu)看，其細(xì)胞間冰晶的直接升華，使其空腔較大、較均勻一致，呈現(xiàn)出較好的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，組織結(jié)構(gòu)整體上較完整[22-23]。熱風(fēng)干燥呈層疊排列結(jié)構(gòu)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則，呈現(xiàn)不同大小的空腔，樣品組織發(fā)生變形、皺縮[23]。本研究中，熱風(fēng)干燥處理的桑葉蛋白質(zhì)發(fā)生顯著的降解，114 個差異蛋白中，62 個在熱風(fēng)干燥處理過程中含量降低。通常，食品加工過程會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子降解，尤其是大分子蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白質(zhì)，而冷凍干燥中大分子蛋白質(zhì)保留率較高。本研究中篩選到11 個分子質(zhì)量超過80 ku 的蛋白質(zhì)中有9 個大分子蛋白質(zhì)在冷凍干燥處理組的含量顯著高于熱風(fēng)干燥處理組，例如：谷氨酸合成酶（W9RLN4，Glutamate synthase[NADH]）、脂氧合酶（W9RJG5，Lipoxygenase）分子質(zhì)量分別為196.8 ku 和100.5 ku，它們在冷凍干燥處理組中的含量分別是熱風(fēng)干燥處理組的1.42 和2.69 倍，表明冷凍干燥有利于大分子蛋白質(zhì)的保留。

圖3 兩種干燥方式的桑葉差異蛋白質(zhì)聚類分析Fig.3 Differential expression proteins clustering analysis of mulberry leaf vegetable with two drying methods

圖4 桑葉菜兩種加工方式的差異蛋白質(zhì)功能分類Fig.4 Function classification of deferential proteins identified in mulberry leaf vegetable with two drying methods

圖5 葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-葡糖苷酶的免疫印跡驗證Fig.5 Western blotting analysis of glucan endo-1，3-beta-glucosidase

冷凍干燥食品由于在升華前先凍結(jié)，形成穩(wěn)定的固體骨架，所以水分升華后，固體骨架基本保持不變，干制品不失原有的固體結(jié)構(gòu)，保持著原有的形狀[25]。研究證明，相對于熱風(fēng)干燥，冷凍干燥的桑葉品質(zhì)最佳，熱風(fēng)干燥造成桑葉的葉綠素、酚類和蛋白質(zhì)損失率較高[16]。本研究中，對兩種加工方式的桑葉菜蛋白質(zhì)組進行比較，發(fā)現(xiàn)葉綠體蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白差異明顯。例如：硫胺素噻唑合酶（葉綠體）（Thiamine thiazole synthase[chloroplastic]，W9S2E9）、細(xì)胞色素P450 704C1（Cytochrome P450 704C1，W9QS47）和微管蛋白（Tubulin beta）在熱風(fēng)干燥處理中含量顯著下降，而這些蛋白質(zhì)在冷凍干燥加工中較好地保留下來，與之前的研究冷凍干燥的桑葉菜皺縮不明顯且顏色較鮮亮一致[16]。此外，熱風(fēng)干燥加工過程可能導(dǎo)致脅迫相關(guān)蛋白含量上升。例如：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶U17（Glutathione S-transferase U17，W9RBX4）與過氧化物酶（Peroxidase，W9RC94）在熱風(fēng)干燥處理中的含量顯著高于冷凍干燥，它們主要參與細(xì)胞抗氧化，維持氧化平衡[24-25]。

4 結(jié)論

本研究基于非標(biāo)記定量技術(shù)對不同干燥方式的桑葉菜蛋白質(zhì)組進行鑒定及差異分析。結(jié)果表明，冷凍干燥處理的桑葉菜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較為完整且蛋白質(zhì)大分子等營養(yǎng)物質(zhì)保留率比熱風(fēng)干燥處理高，使從蛋白質(zhì)分子角度鑒定桑葉菜產(chǎn)品的品質(zhì)成為可能，并為優(yōu)化桑葉菜加工方式奠定了理論基礎(chǔ)。下一步將結(jié)合差異蛋白，分析桑葉菜活性成分。