尉鑫欣，肖功年*，熊 旺，趙廣生，陳 波，龔金炎

（1 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 杭州310023 2 杭州新希望雙峰乳業(yè)有限公司農(nóng)業(yè)部國(guó)家乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心 杭州311100 3 浙江一鳴食品股份有限公司 浙江溫州325400）

牛乳中富含以乳糖為主的多種還原糖和蛋白質(zhì)，加熱引起牛乳變化主要是因美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致大量的氨基酸，尤其是賴氨酸殘基的不可逆改變，使其可利用率降低（被破壞或束縛），從而降低了牛乳中蛋白的消化率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。乳制品中的美拉德反應(yīng)過程分為3 個(gè)階段[2]：第1 階段即蛋白質(zhì)乳糖基化階段，牛乳中的賴氨酸ε-氨基和還原糖（特別是乳糖）相互作用形成Schiff 堿，經(jīng)Amadori重排轉(zhuǎn)化為與蛋白質(zhì)結(jié)合的Amadori 復(fù)合物（1-脫氧-1-氨基）乳糖賴氨酸[3]。如果加熱條件不劇烈或反應(yīng)時(shí)間不持久，生成的Amadori 復(fù)合物是相當(dāng)穩(wěn)定的，是生物不可用的[4]。第2 階段該重排產(chǎn)物會(huì)通過脫水和氧化降解為活性羰基化合物，其中在酸性條件下脫水生成羥甲基糠醛（HMF）需較高加熱溫度，其可發(fā)生褐變（積累后不久）。這些產(chǎn)物比前體糖分子對(duì)氨基更具反應(yīng)性，并且反應(yīng)將會(huì)繼續(xù)進(jìn)行。第3 階段通過氧化、脫水和環(huán)化反應(yīng)形成不可逆的化合物。第1 階段導(dǎo)致乳制品中賴氨酸的可利用率降低，幾乎沒有顏色和風(fēng)味物質(zhì)生產(chǎn)[5]。在牛乳加熱期間主要形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物——乳糖基賴氨酸（Lactulosyl lysine），經(jīng)酸水解可產(chǎn)生糠氨酸[6]?？钒彼嶙鳛镮I 型熱負(fù)荷指示劑常被用于評(píng)估美拉德反應(yīng)的早期階段，不僅可用來監(jiān)測(cè)評(píng)估奶受熱損害的程度，而且可與乳果糖指標(biāo)結(jié)合鑒別復(fù)原乳[7]。

牛乳的巴氏殺菌是一個(gè)基本加工步驟，可改善和延長(zhǎng)保質(zhì)期，因其溫和的熱處理?xiàng)l件[8]而深受人們的喜愛。我國(guó)常規(guī)巴氏殺菌條件是由我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的NY/T939-2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》中所列細(xì)則要求的，過于寬泛且不統(tǒng)一。為追求高效益和延長(zhǎng)保質(zhì)期，很多企業(yè)存在過度加熱現(xiàn)象。完善目前所缺失的牛乳加工工藝參數(shù)，有利于提高我國(guó)國(guó)產(chǎn)奶低受熱、簡(jiǎn)加工、高品質(zhì)的天然競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

本文選用牛乳中含量最多的乳糖以及生成糠氨酸所必需的賴氨酸建立乳糖-賴氨酸模擬體系，分別用LC-MS 法、HPLC 法及OPA 法測(cè)定糠氨酸、乳糖及賴氨酸含量，研究底物配比、反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)糠氨酸生成的影響，為完善巴氏殺菌等低熱乳品加工工藝參數(shù)，提高乳品品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳糖（純度98%）、賴氨酸（純度98%），上海麥克林生化科技有限公司；糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），IRIS Biotech GmbH；β-巰基乙醇（純度≥99%），Sigma Aldlrich Chemie GmbH；色譜純乙腈、甲醇，德國(guó)Merck 公司；色譜級(jí)甲酸、三氟乙酸，上海展云化工有限公司；乙酸銨、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 儀器NBL 214e 電子天平，上海仁沃實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS、Agilent 1260 HPLC，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；AT-HG-1 恒溫鼓風(fēng)干燥箱，山東安尼曼特儀器有限公司；UV-5200PC 紫外-可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；XW-80A 型旋渦混合器，麥科儀（北京）科技有限公司；20 mL 帶螺旋蓋耐熱水解試管，杭州革平化學(xué)試劑商行。

1.2.2 設(shè)備

圖1 自制低熱短時(shí)間加熱設(shè)備Fig.1 Homemade low-heat short-time heating equipment

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸水解時(shí)間對(duì)糠氨酸形成的影響 對(duì)某奶吧采購(gòu)的2 種巴氏殺菌奶和采用自制低熱短時(shí)間加熱設(shè)備進(jìn)行加熱處理的質(zhì)量比為10∶1 的乳糖-賴氨酸反應(yīng)液進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的酸水解處理。每個(gè)梯度做3 次平行。

1.3.2 底物配比對(duì)糠氨酸形成的影響 采用自制低熱短時(shí)間加熱設(shè)備，對(duì)質(zhì)量比分別為12∶1，10∶1，8∶1，6∶1 和4∶1 的乳糖-賴氨酸反應(yīng)液進(jìn)行72℃和80℃加熱15 s 的處理，冰浴后立即放入4℃冰箱中儲(chǔ)存。每個(gè)梯度做3 次平行。

1.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)糠氨酸形成及底物乳糖和賴氨酸含量的影響 通過控制自制設(shè)備中蠕動(dòng)泵流速及水浴鍋溫度，對(duì)質(zhì)量比為10∶1 的乳糖-賴氨酸反應(yīng)液進(jìn)行低熱處理，加熱溫度從68℃到80℃（每次升高2℃），加熱時(shí)間15 s，經(jīng)冰浴后立即放入4℃冰箱中儲(chǔ)存。每個(gè)梯度做3 次平行。

1.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)糠氨酸形成及底物乳糖和賴氨酸含量的影響 通過控制自制設(shè)備中蠕動(dòng)泵流速、水浴鍋溫度以及更換U 型管的長(zhǎng)度，對(duì)質(zhì)量比為10∶1 的乳糖-賴氨酸反應(yīng)液進(jìn)行低熱處理，加熱溫度為68，70，72℃和74℃，反應(yīng)時(shí)間為5，10，15，20，30 s。冰浴后立即放入4℃冰箱中儲(chǔ)存。每個(gè)梯度做3 次平行。

1.4 LC/MS 法測(cè)定糠氨酸含量

參考Troise 等[9]和Schmidt 等[10]的方法，使用外標(biāo)法定量，具體步驟如下：

1）試樣水解液的制備 取2 mL 處理后的反應(yīng)液移入20 mL 帶螺旋蓋耐熱水解試管中，加入6 mL 鹽酸溶液（10.6 mol/L），混勻。密閉試管，置于干燥箱，在110℃下加熱水解18 h。加熱約1 h 后，輕輕搖動(dòng)水解管。待加熱結(jié)束后，將水解管從干燥箱中取出，冷卻后濾紙過濾，濾液待進(jìn)一步處理過濾。

2）試樣水解液中糠氨酸含量的測(cè)定 取1.00 mL 水解濾液（第1 步），用6 g/L 乙酸銨溶液稀釋3 倍，混勻后過0.22 μm 水系濾膜，即可供上機(jī)測(cè)定。

3）液相色譜及質(zhì)譜參考條件 液相色譜參考條件：色譜柱為Agilent XDB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B；流速為0.5 mL/min；洗脫梯度見表1。

質(zhì)譜參考條件：使用正電噴霧（ESI+）電離檢測(cè)，源參數(shù)見表2，以MRM 模式記錄色譜圖，并監(jiān)測(cè)特征轉(zhuǎn)變，其它相關(guān)參數(shù)見表3。

1.5 HPLC 法測(cè)定乳糖含量

參考GB5413.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測(cè)定》[11]中高效液相色譜法測(cè)定乳糖含量，具體步驟如下：

1）試樣處理 稱取0.5 g 處理后的反應(yīng)液于10 mL 容量瓶中，加3 mL、55℃去離子水于超聲波震蕩器中震蕩10 min，用乙腈定容至10 mL 刻度處，靜置數(shù)分鐘，通過0.22 μm 有機(jī)系濾膜過濾，濾液供色譜分析。

2）色譜參考條件 色譜柱為ZORBAX Carbohydrate Analysis（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為V乙腈∶V水=70∶30；流速1 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL；洗脫時(shí)間30 min；示差折光檢測(cè)器條件：溫度35℃。

1.6 OPA 法測(cè)定賴氨酸含量

1）OPA 試劑配制（現(xiàn)配現(xiàn)用） 參考Ferrer等[12]和Gonzales 等[13]方法，使用外標(biāo)法定量，具體步驟如下：用6 mL 水稀釋8.0 mg OPA（溶于2 mL 甲醇中）。用水將下列化合物稀釋至100 mL：50 mL 0.1 mol/L 四硼酸鈉溶液、5 mL 20%十二烷基磺酸鈉（SDS）和0.2 mL β-巰基乙醇。

2）樣液測(cè)定 取200 μL 稀釋10 倍的樣液，加入4 mL OPA 試劑液，混勻后室溫放置2 min，在波長(zhǎng)340 nm 處測(cè)吸光度，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，空白組用蒸餾水代替樣品。每個(gè)樣做3 次平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸水解時(shí)間對(duì)糠氨酸形成的影響

如圖2所示，水解16 h 后，糠氨酸含量基本無顯著變化，為節(jié)約時(shí)間和減少試驗(yàn)誤差，采用110℃加熱水解18 h。

圖2 酸水解時(shí)間對(duì)糠氨酸含量的影響Fig.2 Effect of acid hydrolysis time on furosine content

2.2 底物配比對(duì)乳糖-賴氨酸體系中糠氨酸形成的影響

牛乳中，糠氨酸由氨基酸殘基（主要是蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基）和主要的還原糖——乳糖反應(yīng)產(chǎn)生[14]，是早期美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的第1 個(gè)穩(wěn)定的中間體酸水解產(chǎn)物[15]。本文研究不同質(zhì)量比的乳糖-賴氨酸反應(yīng)體系分別在72℃和80℃下加熱15 s 對(duì)糠氨酸形成的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 底物配比對(duì)乳糖-賴氨酸體系中糠氨酸形成的影響Fig.3 Effect of substrate ratio on furosine formation in lactose-lysine system

表1 糠氨酸的洗脫梯度Table 1 Elution gradient of furosine

表2 糠氨酸的質(zhì)譜源參數(shù)Table 2 Mass spectrometry source parameters of furosine

表3 糠氨酸的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometry parameters of furosine

從圖3可看出，當(dāng)乳糖與賴氨酸質(zhì)量比為4∶1 時(shí)糠氨酸含量較低，隨著二者質(zhì)量比的增大，糠氨酸含量先增加而后有所下降。當(dāng)質(zhì)量比10∶1時(shí)，糠氨酸含量在72℃和80℃加熱15 s 時(shí)均達(dá)到最大值，即1 104.96 μg/mL 和1 451.22 μg/mL。當(dāng)體系質(zhì)量比較低時(shí)，過量的賴氨酸，與一定量乳糖反應(yīng)完后將不再生成糠氨酸，且部分賴氨酸結(jié)構(gòu)可能在加熱過程中發(fā)生改變，不再參與與乳糖羰基的反應(yīng)。而當(dāng)體系質(zhì)量比較高時(shí)，根據(jù)付全意[16]的研究推測(cè)乳糖與賴氨酸的質(zhì)量比主要通過影響反應(yīng)物流動(dòng)性及其分子存在形式影響糠氨酸的形成。由此可得，當(dāng)賴氨酸濃度一定時(shí)，隨著乳糖濃度的增加，單位體積內(nèi)活化分子有效碰撞加劇，促使反應(yīng)進(jìn)行。當(dāng)乳糖濃度達(dá)一定程度時(shí)，該模擬反應(yīng)體系的空間位阻增大，流動(dòng)性變差，阻礙了反應(yīng)進(jìn)行。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)乳糖-賴氨酸體系中糠氨酸形成的影響

加熱對(duì)牛奶的影響有2 種：一是食用安全，即殺滅菌；二是增加牛奶風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。牛乳中富含美拉德反應(yīng)所需的還原糖和氨基酸，在加熱開始時(shí)即開始反應(yīng)，在加熱后儲(chǔ)存期間仍持續(xù)生成糠氨酸。本文研究66～80℃低熱溫度范圍（每次提高2℃）加熱15 s 時(shí)糠氨酸含量的變化情況，結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)乳糖-賴氨酸體系中糠氨酸形成的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on furosine formation in lactose-lysine system

糠氨酸含量總體變化趨勢(shì)為隨溫度的升高而增加，在68～70℃范圍內(nèi)增加較為迅速，而在72℃時(shí)有小幅下降，為1 104.96 μg/mL，而后呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)。張英鋒[17]對(duì)美拉德早期反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜研究數(shù)據(jù)顯示：隨著溫度的升高，乳糖及賴氨酸肽鍵長(zhǎng)度對(duì)糠氨酸生成的影響變小，說明72℃后的糠氨酸含量變化略小于68～70℃的變化。

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)乳糖-賴氨酸體系中乳糖及賴氨酸含量的影響

糠氨酸作為食品熱損傷的指標(biāo)已50 多年，適用于許多食品，特別是乳制品?？钒彼崾怯少嚢彼岱謩e與乳糖、葡萄糖和半乳糖反應(yīng)產(chǎn)生的Amadori復(fù)合物的酸水解產(chǎn)物。反應(yīng)溫度對(duì)乳糖-賴氨酸體系中乳糖及賴氨酸含量的影響見圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)乳糖-賴氨酸體系中乳糖及賴氨酸含量的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on lactose and lysine content in lactose-lysine system

相同加熱時(shí)間（15 s）處理?xiàng)l件下，乳糖及賴氨酸損失率均隨溫度的升高而增大。其中，乳糖損失率在溫度66～74℃范圍呈平緩增長(zhǎng)趨勢(shì)，在74℃后損失明顯增加，且乳糖損失率明顯低于賴氨酸，說明低熱時(shí)乳糖較賴氨酸更為穩(wěn)定、不易分解。賴氨酸損失率在溫度72～80℃時(shí)明顯快于66～70℃，與上述反應(yīng)溫度對(duì)糠氨酸含量的影響趨勢(shì)相似。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳糖-賴氨酸體系中糠氨酸形成的影響

牛乳的熱處理時(shí)間對(duì)于乳加工工藝和糠氨酸生成影響較大。鑒于72℃時(shí)糠氨酸含量有小幅下降，本文研究68，70，72℃和74℃條件下加熱5～30 s 時(shí)乳糖-賴氨酸體系中糠氨酸含量的變化。

由圖6可知，糠氨酸生成量均隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)。在10～15 s 時(shí)糠氨酸生成量增長(zhǎng)顯著，而后趨于平緩。糠氨酸含量在70℃與72℃加熱10～15 s 時(shí)會(huì)有一個(gè)交叉，在模擬體系中加熱68℃到加熱至70℃，糠氨酸含量會(huì)有大幅上升，其原因待查。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳糖-賴氨酸體系中糠氨酸形成的影響Fig.6 Effect of reaction time on furosine formation in lactose-lysine system

較低的反應(yīng)溫度（68℃），反應(yīng)進(jìn)行較慢，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加其趨勢(shì)較于后續(xù)較高溫度而言總體趨于平緩。又因反應(yīng)初期，反應(yīng)物充足，反應(yīng)充分，表現(xiàn)為糠氨酸含量隨時(shí)間菲增加而顯著增加。推斷10～15 s 可能是一個(gè)較敏感的時(shí)間段。

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳糖-賴氨酸體系中乳糖及賴氨酸含量的影響

加熱時(shí)間對(duì)糠氨酸的形成有一定影響，在熱加工過程中反應(yīng)時(shí)間對(duì)牛乳中形成糠氨酸的主要2種物質(zhì)也具有潛在的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖7和8。

由圖7和8 可知，糠氨酸的主要底物對(duì)溫度敏感，經(jīng)自制加熱裝置熱處理5 s 后大幅消耗，而后趨于平緩下降趨勢(shì)。其中，5～10 s 時(shí)乳糖及賴氨酸含量變化趨勢(shì)均趨于平緩，且在此時(shí)間段，溫度對(duì)兩者的影響并不明顯。10 s 后出現(xiàn)一個(gè)明顯的小幅下降，乳糖含量在70℃（10～15 s）的降幅大于72℃時(shí)的，而賴氨酸含量在72℃（10～15 s）的降幅明顯高于70℃的，且乳糖72℃反應(yīng)15 s 時(shí)其剩余含量短暫高于70℃時(shí)的乳糖含量，而賴氨酸含量在72℃反應(yīng)10 s 時(shí)持續(xù)高于70℃的賴氨酸含量。由此推斷，牛乳的低熱加工的關(guān)鍵時(shí)間是10～15 s。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳糖-賴氨酸體系加熱過程中乳糖含量的影響Fig.7 Effect of reaction time on lactose content during heating of lactose-lysine system

3 結(jié)論

1）糠氨酸含量不隨乳糖與賴氨酸配比的增大而增多，在質(zhì)量比為10∶1 時(shí)出現(xiàn)一個(gè)最大值，即體系中乳糖含量越低，被破壞的賴氨酸越少，糠氨酸的生成量越少，表明合理選擇底物配比可減少糠氨酸的生成。

2）溫度在68～80℃范圍加熱15 s，隨著溫度的升高糠氨酸含量呈上升趨勢(shì)；在70～72℃時(shí)糠氨酸含量有小幅下降，而后平緩上升，說明70～72℃這個(gè)溫度區(qū)間是控制糠氨酸生成的關(guān)鍵點(diǎn)，表明合理選擇最優(yōu)加熱溫度可控制糠氨酸的生成。

3）反應(yīng)時(shí)間影響糠氨酸的生成，在10～15 s時(shí)變化明顯。反應(yīng)前10 s 糠氨酸增長(zhǎng)速率、底物乳糖及賴氨酸降低速率趨勢(shì)較緩。

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乳糖-賴氨酸體系加熱過程中賴氨酸含量的影響Fig.8 Effect of reaction time on lysine content during heating of lactose-lysine system