宋恭帥，戴志遠(yuǎn)，2*，沈 清，2，崔益瑋，朱蓓薇，王加斌，鄭平安

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012 3 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 4 海力生集團(tuán)有限公司 浙江舟山316021）

鯊魚(yú)肝油是烷基甘油、角鯊烯等生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源，具有良好的生理保健功能[1]。烷基甘油是一種醚脂質(zhì)化合物，根據(jù)甘油骨架上連接的烷烴鏈飽和度與長(zhǎng)度的不同，主要分為鯊肝醇（十八烷氧基甘油）、鯊油醇（十八一烯烷氧基甘油）、鮫肝醇（十六烷氧基甘油）等[2]。其中，鯊肝醇是烷基甘油重要的組成部分，具有對(duì)抗因細(xì)胞毒類藥物或苯中毒引起的造血系統(tǒng)抑制，抗癌、防癌，促進(jìn)白細(xì)胞增生及抗放射線等作用，是重要的免疫刺激因子[3-4]。目前鯊肝醇富集工藝較為不成熟且不同原料中的鯊肝醇含量參差不齊，在售的鯊肝醇產(chǎn)品為富含鯊肝醇的鯊魚(yú)肝油，大多為化學(xué)合成，而化學(xué)合成的鯊肝醇存在生物活性功效低下等問(wèn)題[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外鯊肝醇分離、純化的方法主要有超臨界流體法、分子蒸餾法、酯交換法、柱色譜法、薄層色譜法（TLC）等[5-6]。V ázquez 等[7]采用超臨界流體萃取技術(shù)分離、純化鯊魚(yú)肝油中的鯊肝醇，得到高純度的鯊肝醇。然而，超臨界流體萃取法設(shè)備投入高，操作相對(duì)復(fù)雜。郭正霞[2]利用氧化鋁柱層析技術(shù)分離、純化鯊肝醇，使鯊魚(yú)肝油不皂化物中鯊肝醇含量明顯提高，其未考察洗脫液、洗脫流速等因素對(duì)柱層析效果的影響。本研究以鯊魚(yú)肝油中不皂化物為原料，采用中性氧化鋁柱層析分離、純化鯊肝醇的工藝，通過(guò)氣相色譜法（GC）與薄層層析法（TLC）分析制備樣品中角鯊烯等活性物質(zhì)，以期為鯊肝醇富集工藝及鯊魚(yú)肝油的高值化利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗制鯊魚(yú)肝油，海力生集團(tuán)有限公司；鯊肝醇標(biāo)品（純度≥98%）、硅烷化試劑（VBSTFA∶VTMCS=99∶1）、100～200 目中性氧化鋁，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；角鯊烯標(biāo)品（純度≥99%），美國(guó)Sigma公司；氫氧化鉀、乙醇（95%）、鹽酸、二氯甲烷、正己烷、無(wú)水甲醇、乙醚、乙酸等均為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B 氣相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；電子天平AL204 型，梅特勒-托利多有限公司；層析柱（Φ3.0 cm×60 cm）、硅膠板（Φ 5.0 cm×10.0 cm），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限工藝；BT50S 蠕動(dòng)泵，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Fresco-21G 臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；Millipore 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不皂化物的提取 參考GB/T 5535.2-2008《動(dòng)植物油脂 不皂化物測(cè)定 第2 部分：己烷提取法》[8]和葉虔臻等[9]的方法提取鯊魚(yú)肝油中不皂化物。稱取50 g 鯊魚(yú)肝油于500 mL 三頸燒瓶中，加入150 mL 1 mol/L 氫氧化鉀-乙醇溶液，在70℃條件下反應(yīng)50 min。待反應(yīng)結(jié)束后，從冷凝管頂部加入150 mL 蒸餾水，冷卻至室溫，再將反應(yīng)液倒入500 mL 分液漏斗中，用200 mL 正己烷萃取3次，合并萃取液，然后用10%乙醇水溶液清洗萃取液至中性。若在清洗過(guò)程中出現(xiàn)乳濁現(xiàn)象，則加少量無(wú)水乙醇破乳。萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水、旋蒸得不皂化物，充氮后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 層析柱的制作 參考龔金炎等[10]的方法制作中性氧化鋁層析柱。稱取250 g 粒徑100～200目的中性氧化鋁與500 mL 蒸餾水混合，加入濃鹽酸，調(diào)節(jié)溶液pH 值至2，保持10 min 后用蒸餾水洗滌至中性。置105℃條件下活化24 h。采用干法裝柱，待氧化鋁界面不再下降，用二氯甲烷洗脫除柱子中的雜質(zhì)，平衡2 h，靜置待用。

1.3.3 TLC 檢測(cè) 參考郭正霞[2]的方法對(duì)樣品進(jìn)行TLC 檢測(cè)，并作適當(dāng)修改。具體操作如下：取硅膠板置于103℃條件下干燥活化1 h，放入干燥器中冷卻至室溫待用。稱取樣品100 mg 溶解于1 mL 二氯甲烷中，毛細(xì)管點(diǎn)樣于TLC 硅膠板上，以V正己烷∶V乙醚∶V乙酸=85∶15∶1 為展開(kāi)液，碘蒸氣顯色。

1.3.4 GC 測(cè)定鯊肝醇將TLC 硅膠板上對(duì)應(yīng)的鯊肝醇條帶刮下，加入500 μL 硅烷化試劑（VBSTFA∶VTMCS=99∶1），于65℃水浴30 min，冷卻后氮?dú)獯祾?，脫除多余溶劑后加? mL 正己烷復(fù)溶，過(guò)濾待測(cè)。加入硅烷化試劑的目的是進(jìn)行衍生化處理。

氣相色譜條件：HP-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：初溫200℃保持5 min 后，以5℃/min 升至280℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，載氣流速1 mL/min。因鯊肝醇標(biāo)準(zhǔn)品需衍生化處理后方可GC 檢測(cè)，故無(wú)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗(yàn)采用峰面積歸一化法分析鯊肝醇的純度。每組樣品重復(fù)測(cè)試3 次。

1.3.5 GC 測(cè)定角鯊烯氣相色譜條件：HP-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：初溫160℃，以15℃/min 升至220℃，保持2 min；然后以5℃/min 升至280℃，保持20 min；最后以5℃/min 升至300℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度250℃，分流比1∶10，進(jìn)樣量1 μL，載氣流速1 mL/min。每組樣品重復(fù)測(cè)試3 次。

準(zhǔn)確稱取25 mg 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL 容量瓶中，加入少量正己烷定容至刻度，配制1 mg/mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用正己烷稀釋，配成質(zhì)量濃度分別為20，50，100，200，400 μg/mL 及800 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。以各質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)DesignExpert 8.0 軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，選取洗脫液比例、上樣量和洗脫流速3 個(gè)因素，每40 mL 為1 個(gè)收集單位，以鯊肝醇純度為響應(yīng)值，做三因素三水平的中心組合試驗(yàn)，以確定氧化鋁柱層析分離富集鯊肝醇最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)面因素水平及編碼值見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表Table 1 The levels and factors of response surface methodology（RSM）

1.3.7 數(shù)據(jù)處理每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和顯著性水平均采用SPSS 21.0 軟件計(jì)算，顯著性分析的置信區(qū)間為95%，用Microsoft Word、Origin 7.5 及Excel 繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 洗脫液比例對(duì)洗脫過(guò)程的影響 上樣量3 g，洗脫流速2 mL/min，研究洗脫液比例（V二氯甲烷∶V無(wú)水甲醇）對(duì)中性氧化鋁柱分析分離純化鯊肝醇的作用效果。

由圖1可知，鯊肝醇純度隨著洗脫劑比例的減少呈先上升后下降的趨勢(shì)。在選擇洗脫液時(shí)，一般先選擇極性較小的溶劑，根據(jù)分離效果再依次增大極性。本試驗(yàn)中甲醇的極性要大于二氯甲烷[11]。當(dāng)僅選擇二氯甲烷為洗脫劑時(shí)，其分離效果要弱于二氯甲烷與甲醇（體積比9∶1）復(fù)配使用，其原因可能是二氯甲烷的極性弱，無(wú)法很好地分離鯊肝醇。而隨著甲醇比例的增加，鯊肝醇的純度不斷下降，這是由于復(fù)配洗脫劑的極性過(guò)強(qiáng)而將部分雜質(zhì)混入鯊肝醇中。最終選定洗脫劑比例（V二氯甲烷∶V無(wú)水甲醇）為9∶1 進(jìn)行優(yōu)化，此時(shí)第7 管鯊肝醇純度最高。

圖1 不同洗脫液比例對(duì)鯊肝醇純度的影響Fig.1 Effects of different eluent ratio on purity of batyl alcohol

2.1.2 上樣量對(duì)洗脫過(guò)程的影響 洗脫液比例（V二氯甲烷∶V無(wú)水甲醇）為9∶1，洗脫流速為2 mL/min，研究上樣量對(duì)中性氧化鋁柱分離、純化鯊肝醇的作用效果。

由圖2可知，上樣量在1～3 g 范圍，鯊肝醇純度隨上樣量的增加而增加，然而上樣量繼續(xù)增加，鯊肝醇純度呈下降的趨勢(shì)。這一結(jié)論與龔金炎等[10]的研究結(jié)果基本一致。分析其原因可能是：當(dāng)上樣量過(guò)低時(shí)，氧化鋁層析柱無(wú)法被充分利用而造成浪費(fèi)，同時(shí)洗脫劑消耗量大，使不皂化物中的鯊肝醇與雜質(zhì)無(wú)法有效分離；而當(dāng)上樣量過(guò)大時(shí)，極易造成氧化鋁層析柱負(fù)載過(guò)大，吸附效率降低。采用上樣量3 g 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。此外，在色譜柱負(fù)載量0.012 g/g 氧化鋁、上樣量3 g 時(shí)，第7 管鯊肝醇純度最高。

圖2 不同上樣量對(duì)鯊肝醇純度的影響Fig.2 Effects of different loadings on purity of batyl alcohol

2.1.3 洗脫流速對(duì)洗脫過(guò)程的影響 洗脫液比例（V二氯甲烷：V無(wú)水甲醇）為9∶1，上樣量為3 g，研究洗脫流速對(duì)中性氧化鋁柱分離、純化鯊肝醇的作用效果。

由圖3可知，鯊肝醇純度隨洗脫流速的升高呈先增加后減小的趨勢(shì)。分析原因可能是：在較低洗脫流速下，鯊肝醇在氧化鋁層析柱中停留時(shí)間變長(zhǎng)，而中性氧化鋁具有很強(qiáng)的吸附作用，從而導(dǎo)致部分鯊肝醇被吸附在層析柱中而無(wú)法被洗脫；當(dāng)洗脫流速過(guò)高時(shí)，不皂化物快速流過(guò)層析柱而使鯊肝醇與雜質(zhì)無(wú)法有效分離。宋恭帥等[12]認(rèn)為柱層析洗脫流速在1～2 mL/min 之間為宜，本研究結(jié)果與之一致。最終選定2 mL/min 為最佳洗脫流速。此外，在洗脫流速為2 mL/min 時(shí)，第7 管鯊肝醇純度最高。

圖3 不同洗脫流速對(duì)鯊肝醇純度的影響Fig.3 Effects of different washout velocity on purity of batyl alcohol

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 模型擬合 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The Box-Behnken design and results

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二項(xiàng)式回歸擬合，得到洗脫液比例A、上樣量B、洗脫流速C 與鯊肝醇純度之間的二次多項(xiàng)回歸方程為：

鯊肝醇純度=18.08+0.84A+0.47B-0.84C+0.71AB+0.87AC+1.04BC-2.01A2-1.66B2-2.02C2。

由表3可知，二項(xiàng)式回歸方程的F 值為35.57，其P 值＜0.0001，差異極顯著；對(duì)方程進(jìn)行失擬項(xiàng)檢驗(yàn)，F(xiàn) 值為2.46，其P 值為0.2020＞0.05，不顯著；從擬合方程的相關(guān)系數(shù)可見(jiàn)，多元二次方程擬合相關(guān)系數(shù)高于0.90，因此擬合的回歸模型可靠，可用來(lái)預(yù)測(cè)響應(yīng)值與反應(yīng)參數(shù)之間的關(guān)系。此外，A、B、C、A2、B2和C2的P 值均小于0.05，說(shuō)明它們對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，且洗脫液比例A 是影響鯊肝醇純度的最主要因素。

表3 二項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in binomial regression model

（續(xù)表3）

2.2.2 響應(yīng)面分析及反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化 根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)值鯊肝醇純度與3 個(gè)因素的等高線及響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖4～6。

圖4 洗脫液比例與上樣量交互作用響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.4 Response surface and its contour plots for the interactive of eluent ratio and loading on batyl alcohol content

圖5 洗脫液比例與洗脫流速交互作用響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 Response surface and its contour plots for the interactive of eluent ratio and washout velocity on batyl alcohol content

圖6 上樣量與洗脫流速交互作用響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.6 Response surface and its contour plots for the interactive of loading and washout velocity on batyl alcohol content

通過(guò)對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果的分析，確定回歸模型預(yù)測(cè)的最佳反應(yīng)參數(shù)為：V二氯甲烷∶V無(wú)水甲醇=9.17∶0.83，上樣量3.11 g，洗脫流速1.93 mL/min，預(yù)測(cè)結(jié)果為18.08%。

2.2.3 驗(yàn)證檢驗(yàn) 為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在以上最優(yōu)條件下做3 次平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。試驗(yàn)組平均值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差小于1%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的參數(shù)條件準(zhǔn)確可靠。

表4 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證Table 4 Validation of response surface models

2.3 鯊肝醇制品組成分析

2.3.1 TLC 結(jié)果 分別對(duì)鯊肝醇與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品、鯊魚(yú)肝油富集前、后樣品進(jìn)行點(diǎn)板顯色分析，結(jié)果如7所示。中性氧化鋁層析柱分離、純化鯊肝醇效果明顯，能將鯊魚(yú)肝油中鯊肝醇與角鯊烯分離。

圖7 薄層層析分析結(jié)果Fig.7 The results of thin layer analysis

2.3.2 組成成分分析 目前，市售的天然鯊肝醇產(chǎn)品主要指富含鯊肝醇的鯊魚(yú)肝油，一般純度在20%左右[6]。本研究對(duì)影響中性氧化鋁層析柱分離、純化鯊肝醇作用效果的主要因素，即洗脫液比例、上樣量及洗脫流速進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)參數(shù)條件，使鯊肝醇純度達(dá)18.23%，此結(jié)果與市售鯊肝醇產(chǎn)品純度相差不大。圖8為鯊肝醇富集前、后的氣相色譜圖。鯊魚(yú)肝油不皂化物氣相檢測(cè)結(jié)果如圖8a所示，不皂化物中主要含有鯊肝醇與角鯊烯2 種活性物質(zhì)，根據(jù)面積歸一法計(jì)算可得鯊肝醇含量為9.42%，角鯊烯含量為69.14%。在洗脫液比例（V二氯甲烷∶V無(wú)水甲醇）為9∶1，上樣量3 g 及洗脫流速為2 mL/min 條件下，鯊肝醇經(jīng)中性氧化鋁層析柱分離純化后的氣相色譜分析結(jié)果如圖8所示，鯊肝醇含量有顯著提升。僅從譜圖看，鯊肝醇與角鯊烯含量的差距在縮短，鯊肝醇占18.23%，而角鯊烯占60.32%。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明中性氧化鋁柱層析技術(shù)能有效分離純化鯊魚(yú)肝油中的鯊肝醇。

圖8 鯊肝醇分離純化前、后氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of batyl alcohol before and after separation and purification

角鯊烯是由6 個(gè)異戊二烯連接而成的高度不飽和的直鏈三萜類化合物，常溫下為淡黃色或無(wú)色油狀液體，具有提高缺氧耐受力功能，抑制微生物生長(zhǎng)，抗菌消炎，調(diào)節(jié)膽固醇代謝等生物活性功效，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)中[14-16]。角鯊烯來(lái)源廣泛，存在于微生物、植物種籽、微藻、鯊魚(yú)肝臟及人體皮脂中[17-18]。然而，因植物及其加工副產(chǎn)物中角鯊烯含量過(guò)低而無(wú)法滿足實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)所需，鯊魚(yú)肝油仍是生產(chǎn)高純度角鯊烯的主要原料[19]。鯊魚(yú)肝油主要含有角鯊烯、烷基甘油及少量EPA、DHA、維生素A 及維生素E等多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)素，是高品質(zhì)魚(yú)肝油之一[20]。為了定量分析富集前、后鯊魚(yú)肝油中角鯊烯含量的變化，繪制角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線。本研究中角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品氣相分析結(jié)果如圖9a所示，由于在測(cè)定角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未衍生化處理，故角鯊烯的出峰時(shí)間約在15.017 min，比圖8中的出峰時(shí)間提前了2.7 min 左右。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9b所示，橫坐標(biāo)為角鯊烯質(zhì)量濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)為峰面積，線性回歸方程為：y=1.9214x+6.089，R2=0.9999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得，富集前角鯊烯純度為54.21%，而富集后角鯊烯純度為49.18%。分析其原因可能是：中性氧化鋁層析柱對(duì)角鯊烯的吸附效果較強(qiáng)，而洗脫液未及時(shí)有效地將角鯊烯洗脫。一般地，常用硅膠柱分離、純化角鯊烯，選擇正己烷與乙酸乙酯復(fù)配作為洗脫液[11]。

圖9 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of squalane standard

綜上所述，中性氧化鋁柱層析能有效分離純化鯊肝醇，并對(duì)鯊魚(yú)肝油不皂化物中的角鯊烯有篩選作用。在今后的研究中可用已脫除角鯊烯的不皂化物為原料進(jìn)行鯊肝醇制品的富集純化。

2.3.3 方法學(xué)驗(yàn)證為了驗(yàn)證GC 儀器的穩(wěn)定性，在鯊魚(yú)肝油不皂化物中添加角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行精密度及回收率的試驗(yàn)。本研究選取10，100，400 μg/mL 與800 μg/mL 進(jìn)行試驗(yàn)。在相同條件下連續(xù)平行測(cè)試3 d，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定5 次，計(jì)算日間精密度和日內(nèi)精密度。由表5可知，在日間精密度與日內(nèi)精密度檢測(cè)中回收率在98.71%～101.98%，RSD 在2.76～8.65，結(jié)果表明該儀器有較高的穩(wěn)定性與精密度。

表5 鯊魚(yú)肝油不皂化物中角鯊烯的精密度與加標(biāo)回收率Table 5 Precision and spike recovery of squalene in shark liver oil unsaponifiables

3 結(jié)論

采用粒徑100～200 目的中性氧化鋁為填料，研究其柱層析制備鯊肝醇制品的方法。采用TLC對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，GC 對(duì)樣品進(jìn)行定量分析并驗(yàn)證儀器穩(wěn)定性與精密度。采用響應(yīng)面法優(yōu)化中性氧化鋁柱層析分離、純化鯊肝醇工藝參數(shù)，得到最佳反應(yīng)參數(shù)為：洗脫液比例（V二氯甲烷∶V無(wú)水甲醇）9∶1，上樣量3 g，洗脫流速2 mL/min，所得鯊肝醇制品純度達(dá)18.23%。對(duì)鯊肝醇富集前、后的組成成分分析可知，中性氧化鋁柱層析分離、純化鯊肝醇的同時(shí)，會(huì)對(duì)不皂化物中角鯊烯的含量造成損失。角鯊烯純度由54.21%減至49.18%。

本文尚未有效分離鯊魚(yú)肝油不皂化物中的鯊肝醇與角鯊烯，今后將繼續(xù)開(kāi)展鯊肝醇分離純化技術(shù)及功能活性等研究。