張菁菁 張久亮 李左安

(1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 湖北武漢 430070；2福建省立醫(yī)院急診科，福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省急診醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建福州 350001)

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤，惡性度高，容易早期轉(zhuǎn)移，死亡率高，一直是骨科領(lǐng)域難以攻克的難題。目前手術(shù)切除聯(lián)合化療治療方案，骨肉瘤患者存活率雖有所提高，但長(zhǎng)期存活率較低；然而不可切除、原發(fā)性或者復(fù)發(fā)性骨肉瘤，預(yù)后較差[1]。因此尋找一種更為有效的藥物或者治療手段迫在眉睫。在眾多治療手段中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一種新的行之有效的方法。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在各種死亡信號(hào)刺激后發(fā)生的一系列瀑布式激活的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過(guò)程[2]。研究發(fā)現(xiàn)許多藥物通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行抗腫瘤治療[3-6]。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的深入研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及產(chǎn)生耐藥性與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。細(xì)胞凋亡的減少可引起腫瘤的發(fā)生，且通過(guò)逃避凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及演進(jìn)。特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療研究的熱門(mén)領(lǐng)域[7]，也成為評(píng)價(jià)腫瘤治療效果的標(biāo)志，為研究有效治療腫瘤的方法提供可靠的依據(jù)。

薏苡為禾本科薏苡屬草本植物，其干燥成熟的種仁被稱(chēng)為薏苡仁，是一種藥食兩用中藥[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，薏苡仁具有抗腫瘤、提高免疫力等作用，主要活性成分為薏苡仁酯[9]。薏苡仁酯抗腫瘤作用的研究由來(lái)已久，1961年，日本學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠腹腔注射薏苡仁乙醇提取物能抑制艾氏腹水癌細(xì)胞的增殖，證實(shí)薏苡仁丙酮提取物顯著抑制子宮頸癌14及腹水型肝細(xì)胞，并認(rèn)為薏苡仁酯是其抗癌活性成分[10]。李大鵬從1975年起研究從薏苡仁中提取抗癌活性成分，研制出“康萊特注射液”，從此掀開(kāi)了薏苡仁抗腫瘤的研究熱潮，并認(rèn)為康萊特抗癌的主要活性成分是薏苡仁酯[11]。研究表明薏苡仁酯能有效抑制鼻咽癌CNE-2R和CNE-2細(xì)胞[12]、人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞[13]、結(jié)腸癌SW480細(xì)胞[14]、人宮頸癌HeLa細(xì)胞[15]、人肝癌BEL-7404細(xì)胞[16]、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[17]、人肺腺癌細(xì)胞A594細(xì)胞[18]等增殖。因此，文章探究薏苡仁酯對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期為骨肉瘤更好的治療提供全新的思路。

1材料與方法

1.1材料

人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)自Hyclone公司(美國(guó))，胎牛血清購(gòu)自浙江天航生物技術(shù)公司，青霉素/鏈霉素購(gòu)自吉諾生物化學(xué)公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)，以及胰蛋白酶購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)公司，細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒Cell Counting Kit-8(CCK-8)購(gòu)于Biosharp公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司，Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司，Hoechst33258染色試劑購(gòu)自biosharp公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 U/mL的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為恒溫37℃，飽和濕度，CO2含量為5%。

1.2.2細(xì)胞活力測(cè)定 將收集的處于對(duì)數(shù)期的的細(xì)胞懸浮液接種于96孔板中，按照每孔100μL細(xì)胞懸浮液(含細(xì)胞5000個(gè))進(jìn)行接種，96孔板邊緣的孔用無(wú)菌PBS填充。待培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入200μL含有不同濃度薏苡仁酯的培養(yǎng)基進(jìn)行處理，空白對(duì)照組不接種細(xì)胞，但給予相應(yīng)的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的細(xì)胞完全培養(yǎng)基處理，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)特定的時(shí)間后，每孔加入20μL的CCK-8溶液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光值。細(xì)胞活力按照下面的公式進(jìn)行計(jì)算：

細(xì)胞活力(%)=[(實(shí)驗(yàn)組平均吸光值-空白對(duì)照組平均吸光值)/(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組吸光值-空白對(duì)照組平均吸光值)]×100。

1.2.3Annexin-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按每孔約2.5×105個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞接種到6孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，給予不同濃度的薏苡仁酯處理24h，收集經(jīng)過(guò)處理之后的細(xì)胞(包括懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞)，PBS洗滌兩次后，取2×105個(gè)細(xì)胞重懸，1000g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，加入500μL的Binding buffer輕輕重懸細(xì)胞。加入5μL的Annexin-FITC，輕輕混勻；再加入5μL的PI，小心振蕩搖勻。置室溫避光條件下孵育10min后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用細(xì)胞爬片法，將細(xì)胞接種到置于6孔板內(nèi)的無(wú)菌蓋玻片上，每孔約2.5×105個(gè)細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)24h后，給予不同濃度的薏苡仁酯處理24h。藥物處理完成后，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞兩遍，多聚甲醛固定15min，然后加100μL濃度為10μg/mL的Hoechst 33258染料進(jìn)行染色，染色時(shí)間為5min，染色結(jié)束后，小心取出蓋玻片，用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞兩次，以洗去未結(jié)合的染料。洗滌完成后，將細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)波長(zhǎng)為350nm。

2結(jié)果

2.1薏苡仁酯抑制MG-63細(xì)胞增殖

CCK-8法顯示，薏苡仁酯作用于MG-63細(xì)胞12h、24h、36h和48h后，不同藥物濃度組存活率呈現(xiàn)劑量-時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)，薏苡仁酯作用于MG-63細(xì)胞12h、24h、36h、48h的IC50值分別為185.60g/L、113.65g/L、116.42g/L、47.60g/L。詳見(jiàn)表1

表1 薏苡仁酯對(duì)MG-63細(xì)胞增殖抑制作用

2.2薏苡仁酯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡過(guò)程中核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化

Hoechst染色如圖1所示，薏苡仁酯作用于MG-63細(xì)胞12h、24h后，對(duì)照組熒光彌散均勻，處理組細(xì)胞核染色質(zhì)形態(tài)學(xué)發(fā)生了改變，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多被稱(chēng)為空穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)，凋亡程度加深是染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，凋亡晚期細(xì)胞核破裂為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。隨著處理濃度加大，凋亡程度也隨之加深。

圖1 薏苡仁酯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡

2.3薏苡仁酯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡

Annexin-FITC/PI雙染法如圖2所示，薏苡仁酯作用于MG-63細(xì)胞24h后，凋亡為9.37%、10.61%、11.73%、14.26%，以晚期凋亡為主。

圖2 薏苡仁酯對(duì)MG-63凋亡的影響

3討論

骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，多發(fā)于兒童及青少年，骨肉瘤的發(fā)病部位常見(jiàn)于長(zhǎng)管狀骨的干骺端[19]。在臨床上，骨肉瘤僅表現(xiàn)為局部疼痛和腫脹，偶伴有關(guān)節(jié)功能障礙，早期極有可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，且發(fā)展迅速[20]。手術(shù)聯(lián)合化療模式，開(kāi)啟了骨肉瘤治療的新時(shí)代。但近幾十年來(lái)，骨肉瘤患者整體的5年生存率約為60%[19]。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明，特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一個(gè)新的行之有效的方法。

薏苡仁酯從中藥薏苡仁中提取，是可供靜脈或者動(dòng)脈直接大劑量輸注的新穎水包油型白色乳狀液體，已證實(shí)可抑制和殺傷多種癌細(xì)胞，對(duì)中晚期腫瘤患者具有一定抗惡病質(zhì)和止痛作用，無(wú)明顯毒副作用[21]。因此，研究薏苡仁酯對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期將薏苡仁酯應(yīng)用于骨肉瘤的臨床治療中提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，隨著同一濃度薏苡仁酯處理MG-63細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，薏苡仁酯對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。相同處理時(shí)間下，隨著處理濃度的加大，薏苡仁酯對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的抑制作用也隨之增大。進(jìn)一步研究薏苡仁酯對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，Hoechst染色顯示薏苡仁酯作用于MG-63細(xì)胞12h、24h后，對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)出均勻彌散熒光，而處理組出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的塊狀熒光。Annexin-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果表明，薏苡仁酯能夠明顯增加凋亡細(xì)胞比例，說(shuō)明薏苡仁酯能夠誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞的凋亡。