王 波 金 雯 楊 梅 王躍華

(1銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)護(hù)理系；2銅陵市人民醫(yī)院腫瘤科 安徽銅陵 244061)

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)行為，在此過程中，惡性腫瘤細(xì)胞可突破基底膜、入侵血液及淋巴循環(huán)從而完成侵襲、轉(zhuǎn)移的目的，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。長鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA，Lnc RNA)并不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，一度被認(rèn)為“毫無價值”。但越來越多的研究表明[1-3]，Lnc RNA在HCC的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，如參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、調(diào)控上下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、影響腫瘤耐藥、促進(jìn)腫瘤微血管生成等。Lnc RNA家族龐大，CTC-459F4.3是新近發(fā)現(xiàn)的成員，相關(guān)報道較為鮮見。因此基于微環(huán)境針對CTC-459F4.3開展HCC早期事件的研究有助于豐富人類對Lnc RNA的進(jìn)一步認(rèn)知。該研究旨在觀察CTC-459F4.3表達(dá)下調(diào)對HCC侵襲、遷移的影響，探討CTC-459F4.3在HCC中對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，以期為HCC早期診治的臨床決策提供新思路。

1材料與方法

1.1材料來源

SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于ATCC細(xì)胞庫。

1.2主要試劑與儀器

CTC-459F4.3 shRNA慢病毒質(zhì)粒(上海吉凱)；DMEM(Gibco，C11995500CP)；RPMI 1640(Gibco，C11875500BT)；胎牛血清(Bio IND，04-002-1A)；Antibiotic-Antimycotic(Lifetechnologies，15240-112)；PBS，pH7.4(Gibco，10010-023)；Trypsin-EDTA(0.05%)(Lifetechnologies，25300-054)；牛血清白蛋白(Lifetechnologies，15561012)； 細(xì)胞培養(yǎng)皿：Coning，430167；細(xì)胞培養(yǎng)板：Costar，3524；75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶：Corning，43063；Transwell小室 ：Corning，3422 (8μm孔徑)；酶標(biāo)儀：BioTek，EPOCH等。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃CO2培養(yǎng)箱中，5%CO2，相對濕度90%。用0.125%胰蛋白酶37℃條件下作用3～5 min。培養(yǎng)基輕洗1次，去除死亡細(xì)胞的碎片及殘余胰酶。加入DMEM / RPMI 1640完全培養(yǎng)基5mL，反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液，接種于25mL培養(yǎng)瓶中，1:2分瓶培養(yǎng)。于對數(shù)期接種于6孔板中，一定滴度的慢病毒滴入每孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞。分別設(shè)CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質(zhì)粒組，采用RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2RT-PCR檢測CTC-459F4.3轉(zhuǎn)染效率 細(xì)胞懸液加入600μL Buffer RL，反復(fù)吹打使其充分裂解、mRNA完全分離；離心后，收集RNA溶液，采用分光光度計定量，估算提取總量10ug，超低溫保存。按照cDNA合成說明書配置反應(yīng)體系；依據(jù)定量PCR試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗。50℃，2min；95℃，10min；40循環(huán)；95℃，15S，60℃，60S。收集數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計算RT-PCR結(jié)果相對表達(dá)量。

表1 引物序列表

1.3.3 Western-Blot檢測 配制12%分離膠和4%濃縮膠；SDS-PAGE 電泳1.5h，電流為濃縮膠25mA，分離膠30mA 。轉(zhuǎn)膜400mA轉(zhuǎn)移0.5h、1% BSA對膜進(jìn)行封閉40min；一抗4℃孵育過夜；二抗孵育37℃孵育1h；PBS清洗3次后，按照試劑盒說明書配制ECL顯色工作液、熒光拍照，凝膠圖像系統(tǒng)分析光密度值。

1.3.4Transwell侵襲、遷移試驗 接種前將24孔板和Transwell小室用1×PBS浸泡5min濕潤；用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1% FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度1×105細(xì)胞/mL，接種到Transwell小室內(nèi)，每個小室分別加0.2mL各組細(xì)胞懸液，下層加入0.8mL含10% FBS的完全培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h；培養(yǎng)12h后，每孔加入1mL4%多聚甲醛溶液，室溫固定15min；吸去固定液，用1×PBS洗滌2次，每孔加入1mL 0.5%結(jié)晶紫溶液，染色60min后用1×PBS洗3次，晾干；用棉簽小心擦去Transwell小室上部內(nèi)沒有遷移的細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析實(shí)驗結(jié)果，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用方差分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1CTC-459F4.3 shRNA轉(zhuǎn)染效率

CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質(zhì)粒組CTC-459F 4.3 mRNA表達(dá)量分別為：0.376±0.0399；0.746±0.492；0.752±0.269；組間比較發(fā)現(xiàn)，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=88.368，p<0.001)；兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.867)。詳見圖1。

圖1 CTC-459F4.3 shRNA慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

2.2Western-Blot檢測結(jié)果

CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質(zhì)粒組E-cadherin表達(dá)量分別為：1.040±0.070；1.334±0.293；1.320±0.162；組間比較發(fā)現(xiàn)，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=40.994，p<0.001)；對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.728)。CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質(zhì)粒組N-cadherin表達(dá)量分別為：1.515±0.162；1.387±0.033；1.393±0.176；組間比較發(fā)現(xiàn)，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.138，p=0.001)；對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.778)。詳見圖1。

圖2 三組Western-Blot檢測結(jié)果

2.3Transwell侵襲檢測結(jié)果

CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質(zhì)粒組穿透下室細(xì)胞數(shù)分別為：137.667±5.686個；51±2.0個；47±2.0個。組間比較發(fā)現(xiàn)，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=585.653，p<0.001)；對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.230)。見圖3。

圖3 三組Transwell侵襲檢測結(jié)果

2.4Transwell遷移檢測結(jié)果

CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質(zhì)粒組遷移細(xì)胞數(shù)分別為：132.67±2.082個；43.33±2.517個；45.33±2.082個。組間比較發(fā)現(xiàn)，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1561.156，p<0.001)；對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.315)。詳見圖4。

圖4 三組Transwell遷移檢測結(jié)果

3討論

HCC作為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其診斷和治療一直以來備受學(xué)者們的矚目。早期切除雖是最有效的手段之一，但總體生存率仍不理想。Lnc RNA家族被發(fā)現(xiàn)在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾介導(dǎo)某些信號基因的表達(dá)，以致惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)行為。EMT是細(xì)胞的上皮屬性減弱或缺失并部分或全部獲得間質(zhì)特性的現(xiàn)象，此過程可使細(xì)胞粘附能力減弱而伴隨運(yùn)動能力的增強(qiáng)。因此，EMT被認(rèn)為是惡性腫瘤包括HCC轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，眾多研究發(fā)現(xiàn)Lnc RNA可以發(fā)揮癌基因作用參與EMT的進(jìn)程。

隨著高通量檢測技術(shù)的進(jìn)步，學(xué)者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少3萬余個Lnc RNA在各類疾病中表達(dá)失調(diào)[4]。部分Lnc RNA被發(fā)現(xiàn)起到促進(jìn)EMT的作用，lncRNA-n335586在HCC中高表達(dá)可通過調(diào)控miR-924/CKMT1A信號軸來實(shí)現(xiàn)正向促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移，侵襲和EMT及體內(nèi)轉(zhuǎn)移[5]。lncRNA-HOTAIR是學(xué)者們研究較多的Lnc RNA之一，HOTAIR高表達(dá)，可通過介導(dǎo)miR-23b-3p-Zeb-1通路增強(qiáng)EMT，促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲、遷移，而Zeb信號基因可以與E-cadherin編碼的CDH1啟動子E2位點(diǎn)結(jié)合實(shí)現(xiàn)對EMT的影響[6]。HOTAIR可以調(diào)控信號蛋白如：阿片類生長因子受體(opioid growth factor receptor，OGFr)的表達(dá)，敲低HOTAIR可調(diào)節(jié)OGFr過表達(dá)從而抑制了HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[7]。此外，還有不少Lnc RNA對EMT進(jìn)程有正向效應(yīng)[8-10]。Lnc RNA家族中也有不少對EMT起抑制作用，lncRNA-CASC2可以通過miR-367-FBXW7信號軸的調(diào)控， 逆轉(zhuǎn)上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，其機(jī)制與lncRNA-CASC2高表達(dá)上調(diào)FBXW7有關(guān)。CADM1-AS1低表達(dá)與HCC晚期分期、早期轉(zhuǎn)移和低生存率相關(guān)，其過表達(dá)可抑制HCC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并通過對PTEN/AKT/GSK-3β信號通路及細(xì)胞周期的調(diào)控誘導(dǎo)HCC細(xì)胞停滯于G0/G1期，發(fā)揮其抑癌基因作用[12]。CTC-459F4.3是新近報道的lncRNA，張軍等研究顯示，CTC-459F4.3基因過表達(dá)能夠抑制HCC的增殖和遷移[13]，而針對該基因的研究，目前尚不多見。

E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin上調(diào)是EMT的特征之一。Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組和空質(zhì)粒組比較，CTC-459F4.3基因敲除組E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，提示CTC-459F4.3基因敲除后可以促進(jìn)EMT。Transwell侵襲試驗結(jié)果顯示CTC-459F4.3基因敲除組肝癌細(xì)胞侵襲數(shù)量多于對照組和空質(zhì)粒組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；Transwell遷移試驗結(jié)果顯示CTC-459F4.3基因敲除組肝癌細(xì)胞遷移數(shù)量多于對照組和空質(zhì)粒組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。上述結(jié)果提示CTC-459F4.3基因敲除后能夠增強(qiáng)HCC的侵襲和遷移能力，促進(jìn)EMT進(jìn)程。

綜上，該研究發(fā)現(xiàn)，CTC-459F4.3可通過調(diào)控E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)，發(fā)揮其抑癌基因的作用，CTC-459F4.3敲除后可以促進(jìn)HCC的EMT進(jìn)程。須要指出的是，有關(guān)Lnc RNA CTC-459F4.3的研究并不多見，其參與HCC侵襲、遷移的機(jī)制尚不清楚。課題組將深入探究CTC-459F4.3與HCC發(fā)展分子機(jī)制的關(guān)系，為完善Lnc RNA基因診斷提供理論依據(jù)。