司波，袁雯雯，顧會會，賈夢瑋，盧永翎，呂麗爽*

1(江蘇省宿遷市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇 宿遷，223800)2(南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京，210023)

活性羰基化合物(reactive carbonyl species，RCS)是一類有害活潑性小分子，如丙烯醛(acrolein，ACR)、丙酮醛(methylglyoxal，MGO)、巴豆醛(crotonaldehyde，CRO)、5-羥甲基糠醛(5- hydroxymethylfurfural，5-HMF)、甲醛(formaldehyde，F(xiàn)OR)、乙醛(acetaldehyde，ACE)。RCS主要存在于環(huán)境污染[1]、動植機(jī)體內(nèi)源性代謝[2]和食品加工貯藏過程中[3-4]。脂質(zhì)氧化、磷脂和脂肪酸氫過氧化物分解、還原糖和蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)均為食源性RCS的主要產(chǎn)生途徑。RCS具有強(qiáng)親電性能，可與不同的細(xì)胞成分(大多數(shù)為親核物質(zhì))發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)[5]。生物分子的巰基、咪唑基、羥基以及嘌呤和嘧啶堿基中的氮、氧原子等強(qiáng)親核位點(diǎn)是其最易攻擊的目標(biāo)，RCS與其相互作用可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸和氨基磷脂的化學(xué)修飾，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性和誘變作用[6-7]。研究證明，RCS與癌癥、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病并發(fā)癥、阿爾茨海默癥、衰老、動脈粥樣硬化等多種疾病密切相關(guān)[8]。因此，食品加工和貯藏過程中產(chǎn)生的RCS，給食品安全帶來潛在危害，成為目前關(guān)注的熱點(diǎn)。

白酒是以糧谷為主要原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、貯存而制成的蒸餾酒。白酒作為我國特色蒸餾酒，產(chǎn)量逐年遞增，飲用白酒的人口也十分龐大，因此，白酒的質(zhì)量安全狀況與我國人民的生命健康息息相關(guān)[9-10]，關(guān)注白酒加工過程中潛在的有害物質(zhì)愈發(fā)重要。國外已在葡萄酒[11]、啤酒[12]、水果蒸餾酒、威士忌、龍舌蘭、白蘭地、朗姆酒[13-15]等酒精飲料中檢測到甲醛、乙醛、乙二醛、丙酮醛、丙烯醛、巴豆醛、糠醛、5-羥甲基糠醛等RCS。目前白酒中有毒有害物質(zhì)研究主要集中在氨基甲酸乙酯[16]、生物胺[17]、氰化物[18]等內(nèi)源性物質(zhì)，以及塑化劑[19]、重金屬[20]、農(nóng)藥殘留[21]、真菌毒素[22]等外源性物質(zhì)，而針對小分子RCS尚未引起足夠重視。研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵以及糧食發(fā)生的美拉德反應(yīng)極大提升了酒體中RCS的形成,因此監(jiān)控白酒中的有害RCS至關(guān)重要。

近年來國內(nèi)外針對RCS的檢測分析主要有熒光光譜法[23]、分光光度法[24]、同位素稀釋質(zhì)譜法[25]、液相色譜法[26]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[27]、電化學(xué)法[28]等。雖然質(zhì)譜聯(lián)用可以同時檢測多種醛類物質(zhì)，但質(zhì)譜成本較高，企業(yè)普及和推廣受限。因此有必要建立同時檢測多種RCS的普通色譜方法。由于白酒中揮發(fā)性物質(zhì)較多，采用氣相色譜法分析RCS，干擾較大；而且氣相色譜選用的共衍生化試劑成本較高；而液相色譜法既能對多種成分實(shí)現(xiàn)有效分離，衍生化試劑簡單易得，成本低，且方法穩(wěn)定性較好、檢測限靈敏度均能達(dá)到預(yù)期效果，在行業(yè)中易于普及推廣。故而本研究擬以2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)作為衍生化試劑，采用HPLC-二級管陣列檢測器(diode array detection，DAD)建立一種同步測定白酒中多種RCS(ACR、MGO、CRO、5-HMF、FOR、ACE)含量的方法，為白酒產(chǎn)品中多種有害RCS的同步檢測以及對白酒釀造加工過程有害RCS產(chǎn)生途徑的監(jiān)控提供有利手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙烯醛(95%)，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；丙酮醛(40%)，美國Sigma-Aldrich公司；巴豆醛(99%)，Adamas-beta試劑；5-羥甲基糠醛(99.7%)，畢得醫(yī)藥；甲醛(100 mg/L)，生態(tài)環(huán)境部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；乙醛(40%)，上海展云化工有限公司；2,4-二硝基苯肼(98%)，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈(色譜純)，德國Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

實(shí)驗(yàn)樣品均通過市售或酒廠取樣方式獲得。酒樣1～3為濃香型(42%vol～52%vol)，由酒廠A、B、C提供；4～6為醬香型(43%vol～53%vol)，由酒廠D、E提供；7～9為清香型(42%vol～53%vol)，由酒廠F、G提供；10～12為鳳香型(42%vol～55%vol)，由酒廠H提供；13～15為芝麻香型(42%vol)，由酒廠I、J提供；16～18為兼香型(40.2%vol～42%vol)，由酒廠K、L提供。濃香型不同加工階段樣品由酒廠J提供，醬香型不同取酒次數(shù)樣品由酒廠M提供。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695液相色譜儀(配有2998二極管陣列檢測器)，美國Waters公司；Thermo Biofuge Stratos超速冷凍離心機(jī)、N-EVAP氮?dú)獯蹈蓛x，美國Organomation公司；Nanopure超純水機(jī)，美國Thermo公司；PWC 254型分析天平，英國ADAM公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

精確吸取適量ACR、MGO、CRO、5-HMF、FOR、ACE標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，加入磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.0)溶解并定容后配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.01、0.01、0.01、0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置于4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確吸取1.3.1.1中儲備液適量于容量瓶中，用磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.0)逐級稀釋至標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其中ACR、CRO、5-HMF、FOR的質(zhì)量濃度為0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5 μg/mL，MGO的質(zhì)量濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3 μg/mL，ACE的質(zhì)量濃度為0.625、1.25、2.5、5.0、12.5、25、50、75 μg/mL。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 成品酒、原酒樣品

參考文獻(xiàn)[29-30]并進(jìn)行優(yōu)化，取適量液體樣品用磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.0)將其酒精度稀釋至10%vol，渦旋混勻，精密吸取3 mL加入4 mg/mL DNPH-乙腈溶液 0.3 mL，加蓋混勻，于50 ℃恒溫水浴振蕩器中避光反應(yīng)1.5 h后冰水冷卻。加入3 mL二氯甲烷，渦旋2 min，10 000 r/min離心15 min，萃取2次，合并二氯甲烷層，氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL乙腈復(fù)溶，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后HPLC檢測。

1.3.2.2 固體原料、酒醅樣品

取一定量固體樣品粉碎，精密稱取5 g，加入50 mL 磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 4.0)，加蓋混勻，浸泡過夜，冰浴超聲30 min后10 000 r/min離心15 min，精確吸取上清液3 mL按1.3.2.1中方法處理樣品，HPLC檢測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Beconsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；檢測波長360 nm(ACR、MGO、CRO、FOR、ACE)/400 nm(5-HMF)；流動相為超純水與乙腈梯度洗脫(0～3 min，乙腈50%；3～12 min，乙腈50%～90%；12～12.5 min，乙腈90%～100%；12.5～15 min，乙腈100%)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制方法

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜峰確立

由圖1可知，通過對RCS共衍生化條件及色譜條件的優(yōu)化，各待測物質(zhì)在液相色譜中分離度良好，空白無雜質(zhì)峰干擾，達(dá)到分析要求。

1-DNPH；2、2′-5-HMF；3-MGO；4-FOR；5-ACE；6-ACR；7-CROA-空白溶液；B-混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液；C-白酒樣品圖1 空白溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液及白酒樣品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of blank sample、mix standard solution and liquor samples

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限及定量限測定結(jié)果

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.2.1進(jìn)行衍生化，按1.3.3進(jìn)行HPLC分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以RCS衍生物峰面積為縱坐標(biāo)y，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。根據(jù)信噪比確定檢出限(RSN=3)以及定量限(RSN=10)。如表1所示，6種RCS呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999以上，檢出限和定量限滿足分析要求。

表1 六種RCS的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equation, correlation coefficient, linear range, limit of detection and limit of quantitation of 6 RCS by HPLC

2.2.2 樣品穩(wěn)定性測定結(jié)果

將混合RCS標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.2.1方法處理后，分別于25、4 ℃避光放置0、1、2、4、8、16、24 h后在1.3.3的色譜條件下測定各RCS衍生物的峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。表2結(jié)果表明在室溫貯存條件下，ACR、MGO、CRO、5-HMF、FOR、ACE的RSD均<5%，但MGO的RSD略高，總體在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。而在4 ℃下，6種目標(biāo)物的RSD均<2%，表明4 ℃條件下穩(wěn)定性更好。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3) 單位：%

2.2.3 加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果

向白酒樣品中分別加入低、中、高3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻后將樣品酒精度稀釋至10%(體積分?jǐn)?shù))，取3 mL按1.3.2.1方法處理，每個加標(biāo)水平平行做6次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相應(yīng)組分的加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見表3。6種RCS平均加標(biāo)回收率為85.39%～105.78%，RSD均<4%，表明該方法精密度良好，準(zhǔn)確度高。

表3 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果(n=6)Table 3 Results of average recoveries and precision (n=6)

2.3 不同香型成品酒中RCS的含量解析

選取18種白酒樣品進(jìn)行測定，包括濃香、醬香、清香、鳳香、芝麻香和兼香型6種香型。采用上述方法測定ACR、MGO、CRO、5-HMF、FOR和ACE含量。結(jié)果見表4，ACR含量為0.21～0.88 μg/mL，MGO含量為0～0.45 μg/mL，CRO含量為0.10～0.94 μg/mL，5-HMF含量為0.03～0.29 μg/mL，F(xiàn)OR含量為0.30～2.73 μg/mL，ACE含量為85.36～215.04 μg/mL。其中大部分樣品中未檢出MGO，檢出部分MGO含量為0.31～0.45 μg/mL；此外所有樣品中均含有85 μg/mL以上的ACE，平均含量高于伏特加(3 μg/mL)、朗姆酒(18 μg/mL)和威士忌(28 μg/mL)等國外蒸餾酒[27]。同時我們發(fā)現(xiàn)醬香型和芝麻香型白酒中ACR、MGO、FOR和ACE含量明顯高于其他香型，芝麻香型和醬香型白酒均采用高溫發(fā)酵工藝，尤其醬香型白酒生產(chǎn)遵循“四高兩長”工藝，即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒，發(fā)酵周期長、貯存期長，高溫處理明顯加快美拉德反應(yīng)、甘油脫水及糖分解等反應(yīng)[1, 21]，由此推測高溫工藝是導(dǎo)致這2種香型白酒中有害RCS含量高于其他香型白酒原因之一。

表4 白酒中6種RCS的含量(n=3) 單位：μg/mL

2.4 醬香型白酒多次取酒RCS的含量變化

醬香型白酒作為我國主體香型之一，占據(jù)較大消費(fèi)市場，采用2次投料，8輪次發(fā)酵，7次取酒，“四高兩長”工藝。由表4可知醬香型白酒中RCS含量最高，因此對2～7次取酒樣品中RCS進(jìn)行分析。由圖2可知，不同次數(shù)所取酒樣中RCS含量存在顯著性差異。我們知道釀造完成取酒過程中，第3、4次取酒產(chǎn)量最高[31]，第3、4、5次的酒口感、香氣最佳。但是我們分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除乙醛外，5種RCS總量最高的為第5次，總量為12.80 μg/mL；第4次與第5次無顯著性差異，為12.49 μg/mL。在這些酒體樣品中，乙醛含量遠(yuǎn)高于其他4種醛類。其中第3次取酒乙醛含量遠(yuǎn)高于其他取酒樣品，推測隨著發(fā)酵時間的延長，微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生的RCS化合物含量存在增加趨勢，到后期這些醛類隨著取酒產(chǎn)量和酒體內(nèi)容物含量的降低而降低。

A-5-HMF、FOR、CRO、MGO含量；B-ACE含量圖2 醬香型白酒不同取酒次數(shù)對RCS含量的影響Fig.2 The contents of RCS of different times in taking Maotai-flavor liquor

2.5 濃香型白酒不同加工階段RCS的含量變化

在我國所有白酒香型酒中濃香型的產(chǎn)量最大，生產(chǎn)采用混蒸續(xù)糧固態(tài)發(fā)酵法，中偏高溫發(fā)酵，采用“跑窖”、“原窖”、“老五甑”工藝；“兩高一長三適當(dāng)”(即入窖淀粉高，酸度高，長期發(fā)酵，適當(dāng)?shù)乃帧囟群涂窔び昧?。濃香型白酒在發(fā)酵結(jié)束開窖時，將大部分糟醅取出，在窖池底部留少部分糟醅進(jìn)行再次發(fā)酵，經(jīng)過2輪發(fā)酵期滿的這部分酒醅，即稱為“雙輪發(fā)酵糟”，所釀出的酒為“雙輪底發(fā)酵酒”，此為延長發(fā)酵期的一種工藝方法。為考察濃香型白酒加工過程中RCS產(chǎn)生的規(guī)律，對白酒加工不同階段取樣進(jìn)行測定，前期固體樣品包括：潤料、入窖發(fā)酵前原料、出窖堆積原料；液體酒樣品包括：發(fā)酵上層、發(fā)酵中層、發(fā)酵下層、雙輪底酒樣。結(jié)果見圖3，固體原糧從潤料到出窖堆積產(chǎn)生的RCS總量升到最高值，而液體發(fā)酵餾出酒液中雙輪底樣品RCS含量最高；其次是中層發(fā)酵酒樣含量較高。推測其原因?yàn)槌鼋讯逊e過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)導(dǎo)致RCS上升；而雙輪底為2次發(fā)酵，中層酒樣發(fā)酵也是發(fā)酵過程相對比較充分，使得兩者產(chǎn)生的RCS較多。除含量最高的ACE之外，針對不同種類的RCS，上層酒樣中MGO含量最高，中層酒樣中CRO含量最高，雙輪底樣品中ACR、FOR和5-HMF最高。其原因有待進(jìn)一步研究。另外，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)潤料后的釀酒原料，也含有一定量的RCS。

RS-潤料樣品；FS-入窖發(fā)酵前；DS-出窖堆積；UL-發(fā)酵上層酒樣品；ML-發(fā)酵中層酒樣品；LL-發(fā)酵下層酒樣品；SL-雙輪底發(fā)酵酒樣品；mg/kg-固體樣品RS、FS、DS的單位；μg/mL-液體樣品UL、ML、LL、SL的單位A-ACR、MGO、CRO、FOR、5-HMF含量；B-ACE含量圖3 濃香型白酒各加工階段RCS的含量Fig.3 The contents of RCS in each processing stage in Luzhou-flavor liquor

3 結(jié)論

本研究建立了一種同時測定ACR、MGO、CRO、FOR、ACE的方法，以DNPH為衍生化試劑，在50 ℃條件下反應(yīng)1.5 h，采用Beconsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以純水為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫40 ℃，二極管陣列檢測器，檢測波長360 nm(ACR、MGO、CRO、FOR、ACE)/400 nm(5-HMF)。各RCS的線性范圍較寬，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，檢出限1～8 ng/mL，定量限3～25 ng/mL，加標(biāo)回收率為85.39%～105.78%，RSD均<4%，該方法準(zhǔn)確度高，回收率好。對白酒成品樣品和加工過程中原糧和發(fā)酵酒原液分析發(fā)現(xiàn)，醬香型和芝麻香型成品白酒的RCS物質(zhì)明顯高于其他香型，推測與其高溫發(fā)酵工藝相關(guān)；醬香型白酒8輪發(fā)酵，7次取酒過程中，RCS總體含量最高的為第3、4和5次。濃香型白酒原料出窖堆積過程中產(chǎn)生的RCS升至最高，液體發(fā)酵酒原液中雙輪底和中層發(fā)酵酒樣品含量分列前2。由于白酒微生物發(fā)酵過程相當(dāng)復(fù)雜，高溫反應(yīng)與發(fā)酵過程交織，活潑羰基化合物的形成機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。