王定康，張 良，鄒江鵬，車經緯，李 丹，金 垚，周榮清，吳重德,*

(1.四川大學 輕工科學與工程學院， 四川 成都 610065；2.瀘州老窖集團有限責任公司， 四川 瀘州 646000)

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)因具有產醇、產香、增鮮等重要功能，被廣泛應用于豆瓣、醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產過程中[1-2]。由于這些發(fā)酵食品常常在高滲透壓環(huán)境下生產，魯氏酵母菌不可避免的會經受鹽脅迫、酸脅迫和氧脅迫等[3]。近年來，魯氏酵母菌抵抗脅迫的能力已得到國內外研究者的廣泛關注，但對進一步提高魯氏酵母菌的脅迫抗性的策略及其機理還缺乏完整的認識。

預適應處理作為一種提高微生物脅迫抗性的策略[4]，通過使細胞預先暴露于亞致死的脅迫條件下，隨后細胞會表現出對相同或不同應激因子更高的抵抗力[5]。酸適應性反應機制(acid tolerance responses, ATR)是常見的預適應保護機制。何桂強等[6]考察了嗜鹽四聯球菌經過pH值為4.5的酸預適應處理60 min后，再經過pH值為2.5的酸致死脅迫60 min，其存活率比未經預適應處理的細胞顯著提高。Hartke等[7]研究表明，乳酸乳球菌乳亞種細胞在pH值為5.5的酸預適應處理30 min后，可顯著提高酸致死脅迫(pH值為3.9)的存活率。除了酸預適應處理外，有關熱預適應處理和冷預適應處理也有報道。Broadbent等[8]研究發(fā)現，嗜酸乳桿菌NCFM、干酪乳桿菌LC301和瑞士乳桿菌LH212分別在50、42、52 ℃預適應處理20 min后，再分別經受63、54、63 ℃致死脅迫時，與未經預適應處理的細胞相比，細胞存活率分別提高到處理前的27、5、11倍。Cheng等[9]研究表明，生防酵母菌經過40 ℃預適應處理30 min，可以提高其對鹽脅迫(175.5 g/L NaCl)耐受性。Mitchell等[10]揭示了釀酒酵母菌經過輕度的熱脅迫或酒精脅迫處理后，可提高其抵御強氧化應激的能力。酸、熱、冷等預適應處理的方法已有部分研究報道，但有關鹽預適應處理提高細胞抗逆性能的策略及機制方面的研究鮮有報道。

本研究以魯氏酵母菌為研究對象，擬用鹽預適應處理的策略提高魯氏酵母菌高鹽脅迫抗性，并對預適應后細胞生理特性進行解析，希望為篩選高活性的魯氏酵母菌及其在傳統(tǒng)食品發(fā)酵生產中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏酵母菌(ZygosaccharomycesrouxiiCGMCC 3791)，本實驗室從百年老字號釀造企業(yè)(四川省郫縣豆瓣股份有限公司)的豆瓣醬本醅中分離獲得，并經過26S rDNA和ITS區(qū)域序列測序、鑒定、命名，保藏于中國普通微生物菌種保藏中心。超微量Na+/K+- ATPase試劑盒，南京建成生物公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸- 醋酸鉀(HEPES- KAc)細胞裂解緩沖液，北京雷根生物公司；2′,7′-二(羧乙基)- 4或5-羧基熒光素、二乙酰甲酯(BCECF AM)熒光探針，北京百奧萊博科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SW- CJ- 2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；TU- 1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；GL- 20G- Ⅱ型高速冷凍離心機，上海安亨科學儀器廠；92- IIN型超聲波破碎粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ500型分析天平，常熟雙杰測試儀器廠；Trace GC Ultra- DSQII型氣相色譜- 質譜聯用儀，美國賽默飛世爾科技公司；A300型氨基酸分析儀，德國默曼博爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1鹽脅迫實驗

分別取20 mL對數生長中期的魯氏酵母菌細胞，離心(10 000g、4 ℃、5 min)，洗滌后重懸于不同質量濃度(0、60、120、180、350 g/L)NaCl的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃處理90 min，收集菌體并洗滌兩次，進行菌落計數。

1.3.2鹽預適應處理和鹽脅迫實驗

選取合適的鹽預適應濃度范圍和細胞致死鹽濃度，進行后續(xù)鹽預適應和鹽脅迫實驗。細胞分別在不同質量濃度(0、60、120、180 g/L)NaCl的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃處理90 min；再重懸于350 g/L NaCl的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃處理90 min。收集菌體并洗滌兩次，進行菌落計數。選取較佳的鹽預適應濃度條件，進行后續(xù)細胞生理指標測定。

1.3.3鹽預適應處理對細胞生理影響的指標測定

1.3.3.1 胞內pH值的測定

參考文獻[11]的方法：取20 mL培養(yǎng)液離心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌體，用50 mmol/L HEPES- KAc (pH值8.0)緩沖液洗滌2次，重懸于等體積的相同緩沖液中；加入1 μL BCECF AM熒光探針，30 ℃溫水浴20 min；用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH值7.0)洗滌3次，重懸于等體積的該緩沖液中。根據文獻[12-13]所述方法，用熒光分光光度計測定菌懸液熒光強度(Itotal)和上清液熒光強度(Ifiltrate)，其中激發(fā)波長為488 nm和440 nm，發(fā)射波長為535 nm，狹縫寬度均為5 nm。熒光強度的計算方法見式(1)。

I=[(I490)total-(I490)flitrate]/[(I440)total-(I440)flitrate]，

(1)

再根據lgI的值由標準曲線計算胞內pH值。

1.3.3.2 Na+/K+- ATPase活力的測定

取20 mL培養(yǎng)液離心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌體。將菌體重懸于1 mL 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)中，冰浴超聲(工作3 s，間歇2 s，全程25 min，功率400 W，保持溫度4 ℃)。用超微量Na+/K+- ATPase活力測定試劑盒檢測Na+/K+- ATPase活力。采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標準蛋白進行計算。Na+/K+- ATPase活力以單位標準蛋白中含有的Na+/K+- ATPase酶活力表示，U/mg。

1.3.3.3 細胞膜脂肪酸的提取和測定

取20 mL培養(yǎng)液離心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌體。參照Wu等[14]的方法提取細胞膜脂肪酸和制備脂肪酸甲酯，用0.22 μm濾膜過濾。采用氣相色譜- 質譜聯用儀對樣品進行測定，測定條件參照Zheng等[15]的方法進行，由峰面積計算脂肪酸的相對含量。脂肪酸不飽和度和平均碳鏈長度的計算方法見式(2)和式(3)。

(2)

(3)

式(2)中，UFAP為不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例，%；SFAP為飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例，%。式(3)中，FAP為單個脂肪酸占總脂肪酸的比例，%；C為脂肪酸碳原子數。

1.3.3.4 胞內氨基酸含量的測定

取20 mL培養(yǎng)液離心(8 000g, 4 ℃, 5 min)，收集菌體。將菌體重懸于1 mL 50 mmol/L的PBS (pH值7.0) 緩沖液中，置于沸水中15 min，離心(8 000g、4 ℃、5 min)，取上清液。添加100 μL質量分數為10%的磺基水楊酸沉淀蛋白，用0.22 μm濾膜過濾，隨后參照Cui等[16]的方法，用氨基酸分析儀測定游離氨基酸的含量。

1.4 數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值。采用軟件SPSS 19.0對數據進行統(tǒng)計學分析，以 One-way ANOVA 進行顯著性檢驗，并采用ORIGIN 8.5對數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫處理對魯氏酵母菌存活率的影響

本研究團隊前期已對魯氏酵母菌在不同NaCl濃度下生長曲線進行了測定，當培養(yǎng)基中未添加NaCl時，與添加了NaCl的溶液相比，Z.rouxii的生物量更高[17-18]。本研究為篩選合適的鹽預適應條件，考察了魯氏酵母菌在不同NaCl濃度下處理90 min的存活率變化，實驗結果見圖1。由圖1可知，以未添加NaCl處理90 min，細胞存活率為100%計算，細胞在60、120、180 g/L的NaCl和飽和NaCl質量濃度(350 g/L)下處理90 min，存活率分別為96.37%、80.49%、43.67%和19.04%；因此，選取60～180 g/L NaCl質量濃度為鹽預適應濃度范圍，350 g/L NaCl質量濃度為高鹽脅迫條件，進行后續(xù)鹽預適應處理對高鹽脅迫耐受性能的考察。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 不同濃度NaCl脅迫處理對Z. rouxii 存活率的影響Fig.1 Effects of stress treatment with different NaCl contents on survival rate of Z. rouxii

2.2 鹽預適應對魯氏酵母菌高鹽脅迫耐受性的影響

考察了不同濃度NaCl預適應處理對魯氏酵母菌高鹽脅迫下存活倍數的影響，實驗結果見圖2。由圖2可知，以未經鹽預適應直接進行高鹽脅迫(350 g/L，90 min)的細胞存活倍數為1計算，經過60、120、180 g/L的NaCl預適應前處理90 min，細胞存活倍數分別提高到處理前的2.06、2.53、1.92倍，可見鹽預適應處理可提高細胞的高鹽脅迫耐受性；質量濃度為120 g/L的NaCl預適應處理效果最為明顯，選取該條件作為最佳預適應處理條件。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 不同濃度NaCl預適應處理對魯氏酵母菌高鹽 脅迫下存活倍數的影響Fig.2 Effects of NaCl preadaptation on survival fold of Z. rouxii stressed with high salinity stress

2.3 鹽預適應對魯氏酵母菌生理特性的影響

2.3.1鹽預適應對胞內pH值的影響

本研究為探究鹽預適應處理提高魯氏酵母菌細胞耐鹽性的機制，對鹽預適應處理前后細胞生理特性變化進行了分析。首先考察了魯氏酵母菌在鹽預適應前后，以及鹽脅迫過程中胞內pH值的變化，實驗結果見圖3。由圖3可知，預適應前的細胞(before preadaptation, BP)胞內pH值為6.11，細胞直接經過鹽脅迫(salt stress, SS)后，胞內pH值急劇下降至4.83；當經過質量濃度為120 g/L的NaCl預適應90 min后(salt preadaptation, SP)，細胞的胞內pH值為5.31，并且經過鹽預適應處理的細胞，再進行鹽脅迫處理(salt preadaptation to salt stress, SP- SS)，胞內pH值為5.10。因此，鹽脅迫導致了胞內pH水平顯著降低，而經過鹽預適應處理后的細胞再經鹽脅迫，比未經鹽預適應直接進行鹽脅迫的細胞保持了更高的胞內pH值。有研究表明，細胞的胞內pH值與細胞生長、細胞黏附、細胞內吞有關，胞內pH值的降低伴隨著細胞生長活性的減弱[19]，可見鹽預適應處理可以幫助細胞維持胞內pH值的相對穩(wěn)定，從而提高細胞對鹽脅迫的耐受性。

BP—預適應前；SP—鹽預適應處理后；SS—直接高鹽脅迫；SP- SS—先經鹽預適應再高鹽脅迫。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 鹽預適應對魯氏酵母菌胞內pH值的影響Fig.3 Effects of salt preadaptation on intracellular pH value of Z. rouxii

2.3.2鹽預適應對Na+/K+-ATPase活力的影響

Na+/K+- ATPase是公認的評價細胞鹽適應能力的生物標志物，在許多生理過程中起著關鍵作用，包括轉運營養(yǎng)物質、調節(jié)滲透壓、調節(jié)細胞體積等[20-21]。本研究測定了鹽預適應對魯氏酵母菌胞內Na+/K+- ATPase活力的影響，實驗結果見圖4。由圖4可知，細胞經過鹽預適應(SP)后，Na+/K+- ATPase活力由預適應前(BP)的0.708 U/mg上升到1.081 U/mg，并且經過鹽預適應前處理的細胞，在鹽脅迫過程中(SP- SS)的Na+/K+- ATPase活力(1.087 U/mg)顯著高于未經預適應直接進入鹽脅迫(SS)的細胞(0.651 U/mg)。由細胞膜上的離子梯度產生的膜電位是多種細胞內活動的基礎，而Na+/K+- ATPase可維持細胞內最佳的Na+和K+梯度[22]。Petrezs等[23]證實了釀酒酵母菌可上調表達Na+/K+- ATPase的活力來抵御高鹽脅迫。本研究結果表明，鹽預適應處理有助于提高胞內Na+/K+- ATPase活力，從而增強了細胞鹽脅迫耐受性。

BP—預適應前；SP—鹽預適應處理后；SS—直接高鹽脅迫；SP- SS—先經鹽預適應再高鹽脅迫。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 鹽預適應對魯氏酵母菌胞內Na+/K+- ATPase 活力的影響Fig.4 Effects of salt preadaptation on intracellular Na+/K+- ATPase activity of Z. rouxii

2.3.3鹽預適應對細胞膜脂肪酸組成的影響

研究了預適應對鹽脅迫條件下細胞膜脂肪酸組成的影響，實驗結果見圖5。由圖5可知，與未經預處理(BP)的細胞相比，鹽預適應(SP)處理導致細胞膜飽和脂肪酸(棕櫚酸C16:0，硬脂酸C18:0)的相對含量分別減少至處理前的93%和79%，不飽和脂肪酸(棕櫚油酸C16:1，油酸C18:1和亞油酸C18:2)的相對含量分別增加到處理前的1.93和1.61倍。值得注意的是，鹽脅迫后，與未經鹽預適應直接鹽脅迫(SS)的細胞相比，先經過鹽預適應(SP- SS)的細胞，其棕櫚酸C16:0和硬脂酸C18:0的相對含量分別減少至93%和60%，而棕櫚油酸C16:1、油酸C18:1和亞油酸C18:2的相對含量分別增加到處理前的2.55、1.78、1.39倍。在釀酒酵母菌中也發(fā)現了相似的現象，Guo等[24]研究表明，釀酒酵母菌在酸脅迫后，其棕櫚酸C16:0的相對含量降低，油酸C18:1的相對含量升高，并且過量表達編碼去飽和酶的基因OLE1，會提高油酸C18:1的相對含量，脂肪酸不飽和指數也會增加，導致釀酒酵母菌耐酸性能顯著提高。

BP—預適應前；SP—鹽預適應處理后；SS—直接高鹽脅迫；SP- SS—先經鹽預適應再高鹽脅迫。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5 鹽預適應對魯氏酵母菌細胞膜脂肪酸組成的影響Fig.5 Effects of salt preadaptation on changes of membrane fatty acids proportion of Z. rouxii

分析了細胞膜脂肪酸的不飽和度和平均碳鏈長度的變化，實驗結果見圖6。由圖6可知，經過鹽預適應(SP)的細胞與預適應前相比(BP)，其不飽和度增加到處理前的1.93倍，并且先經過鹽預適應前處理的細胞(SP- SS)，在鹽脅迫條件下，其不飽和度是未經鹽預適應直接鹽脅迫(SS)細胞的2.28倍。細胞膜脂肪酸平均碳鏈長度分析表明，鹽脅迫后(SS)的細胞比鹽脅迫前(BP)的細胞平均鏈長略有增加，但SP- SS細胞與SS細胞無顯著差異。研究表明，在不利的釀造環(huán)境中，脂肪酸對釀酒酵母的細胞膜和細胞整體代謝活力起著重要的維持作用[25]，脂肪酸不飽和指數的增加，會有助于細胞抵抗鹽脅迫[26-27]。這種現象的原因是含有較高比例不飽和脂肪酸的膜結構松散，流動性更強，有利于抵御滲透脅迫[28]。由此可見，預適應處理能夠幫助細胞調節(jié)膜脂肪酸的組成，提高不飽和脂肪酸的比例，從而增強細胞耐受高鹽濃度的能力。

BP—預適應前；SP—鹽預適應處理后；SS—直接高鹽脅迫，平均碳鍵長度以碳原子數表示。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 鹽預適應對魯氏酵母菌鹽脅迫條件下細胞膜 脂肪酸不飽和度和平均碳鏈長度的影響Fig.6 Effects of salt preadaptation on changes of unsaturation degree and mean chain length of Z. rouxii during salt stress

BP—預適應前；SP—鹽預適應處理后；SS—直接高鹽脅迫；SP- SS—先經鹽預適應再高鹽脅迫。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 鹽預適應對魯氏酵母菌鹽脅迫條件下胞內 氨基酸含量的影響Fig.7 Effects of salt preadaptation on changes of intracellular amino acids contents of Z. rouxii during salt stress

2.3.4鹽預適應對胞內氨基酸含量的影響

氨基酸作為細胞內重要的相容性溶質，可平衡細胞內外的滲透壓，增強細胞抵抗外界的脅迫能力[29-30]。本研究測定了在預適應和鹽脅迫過程中細胞內氨基酸含量的變化，實驗結果見圖7。由圖7可知，當細胞經過鹽預適應(SP)后，有3種氨基酸[脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)]的含量比預適應前(BP)增加，4種氨基酸[纈氨酸(Val)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)和賴氨酸(Lys)]的含量降低；當比較經過鹽預適應前處理的細胞(SP- SS)和無預適應直接鹽脅迫的細胞(SS)胞內氨基酸含量時，發(fā)現絲氨酸、蘇氨酸和賴氨酸的含量更高。研究表明，魯氏酵母菌可通過提高編碼半胱氨酸裂合酶和蘇氨酸合成酶基因的表達水平，使胞內積累一定量的半胱氨酸和蘇氨酸來抵御鹽脅迫[17]。由此可見，鹽預適應處理可幫助細胞在高鹽脅迫條件下保持胞內氨基酸的水平，從而更有利于細胞的存活。

3 結 論

研究了鹽預適應對魯氏酵母菌高鹽脅迫抗性的影響。先后考察了鹽脅迫對魯氏酵母菌存活率的影響，以及鹽預適應對魯氏酵母菌耐受高鹽脅迫抗性的影響，并從胞內微環(huán)境(胞內pH水平、Na+/K+- ATPase活力、胞內氨基酸含量)和細胞膜脂肪酸組成的角度解析了細胞在鹽預適應過程以及鹽脅迫條件下的生理特性變化。結果表明：經過120 g/L NaCl處理90 min，細胞的耐鹽性最為明顯；當比較先經鹽預適應再高鹽脅迫細胞與直接高鹽脅迫的細胞時，發(fā)現細胞內pH值和Na+/K+- ATPase活力更高，并且先經鹽預適應再高鹽脅迫細胞具有相對含量更低的飽和脂肪酸(棕櫚酸C16:0，細胞內硬脂酸C18:0)和更高的不飽和脂肪酸(棕櫚油酸C16:1，油酸C18:1，亞油酸C18:2)，從而具有更高細胞膜脂肪酸的不飽和度；而胞內氨基酸絲氨酸、蘇氨酸和賴氨酸的含量也更高。希望本研究結果可以為進一步理解預適應保護魯氏酵母菌抗逆的生理機制，為高活性魯氏酵母菌的制備和工業(yè)應用提供理論參考。