莫 玲，香慶文，李晶晶，葉玉萍，趙超超

(桂林醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

蛋白質(zhì)是孕哺期非常重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，該時(shí)期攝取的蛋白質(zhì)的質(zhì)量直接關(guān)系到母嬰健康，尤其在對(duì)胎兒的健康非常重要。原乳及乳制品中含有較多的不飽和脂肪酸、氧化酶和金屬催化劑類等成分，可能會(huì)在加工和貯藏過(guò)程中誘導(dǎo)乳蛋白發(fā)生氧化，使其理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而影響營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，甚至可能會(huì)產(chǎn)生有害化合物[1-4]。前期研究證實(shí)，孕哺期攝入氧化乳蛋白膳食后，子代小鼠腸道抗氧化防御能力和學(xué)習(xí)記憶能力均受到影響[5-6]。在乳制品中，脂肪和蛋白質(zhì)都是非常重要的營(yíng)養(yǎng)成分，乳脂肪氧化對(duì)乳制品的影響已被大眾所接受，但是乳蛋白氧化尤其是乳脂肪氧化與乳蛋白氧化之間的關(guān)系及對(duì)機(jī)體的影響仍未引起大家的關(guān)注。Ventanas等[7]和Soyer等[8]研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物有明顯的相關(guān)性，脂肪的氧化會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化，而蛋白質(zhì)氧化往往也會(huì)伴隨著脂肪的氧化[9]。前期研究證實(shí)，脂肪含量降低，蛋白質(zhì)氧化程度下降[10]。目前，孕哺期膳食中，飼喂不同脂肪含量的氧化乳蛋白對(duì)子代小鼠氧化還原狀態(tài)及健康狀況研究較少，本研究希望通過(guò)建立孕哺期不同脂肪含量的氧化蛋白飲食小鼠模型，系統(tǒng)研究氧化乳蛋白對(duì)子代小鼠氧化還原狀態(tài)的影響，為孕哺期的飲食提供一定理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶，市售純牛奶；HCl、NaOH、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、三氯乙酸(trichloroethanoic acid，TCA)，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(hydrogen peroxidase，CAT)、脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，HNE)試劑盒，廈門慧嘉生物有限公司；KM小鼠SCXK桂2013-0001，桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

DW- 86L828J型醫(yī)用超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司；S- HH- W21- 600S型電熱恒溫三用水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Elx808型多功能酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限(中國(guó))有限公司；DD5型臺(tái)式乳脂離心機(jī)，湖南赫西儀器有限公司；CTFD- 12S型冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1氧化乳蛋白制備

1.3.1.1 全脂氧化乳蛋白制備

全脂乳蛋白質(zhì)量濃度為3.2 g/100 mL，將0.05 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液與全脂乳混合制備成蛋白質(zhì)含量為20 mg/mL的溶液，置于燒杯中，在100 ℃條件下水浴加熱90 min，加熱期間用玻璃棒連續(xù)攪拌。冷卻后冷凍干燥處理，于-20 ℃保存、備用。采用凱氏定氮法測(cè)定凍干乳粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是20.3%。

1.3.1.2 低脂氧化乳蛋白制備

將全脂乳加熱至40 ℃，在轉(zhuǎn)速5 000 r/min條件下離心30 min，去除上層乳脂得到低脂乳，將0.05 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液與低脂乳混合制備成蛋白質(zhì)含量為20 mg/mL的溶液，置于燒杯中，在100 ℃條件下水浴加熱90 min，加熱期間用玻璃棒連續(xù)攪拌。冷卻后冷凍干燥處理，于-20 ℃保存、備用。采用索氏抽提法測(cè)定其脂肪密度為1.9 g/100 mL。采用凱氏定氮法測(cè)定凍干乳粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是24.6%。

1.3.2乳蛋白氧化指標(biāo)的測(cè)定

以未經(jīng)氧化的純牛乳為空白對(duì)照組，測(cè)定全脂氧化乳蛋白和低脂氧化乳蛋白樣品中羰基、游離巰基含量。游離巰基含量測(cè)定按照Boatright的方法[11]，羰基含量測(cè)定按照Oliver的方法[12]。

1.3.3實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)

清潔級(jí)KM小鼠，雄性9只，雌性18只，7周齡，體重20～22 g。在無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)動(dòng)物房觀察室以正常飼料預(yù)飼1周，觀察其體重、糞便、進(jìn)食、飲水、活動(dòng)狀態(tài)等情況，剔除病弱小鼠后按體重隨機(jī)分為3組，每組小鼠雌雄比例為2∶1合籠，以發(fā)現(xiàn)陰栓作為合籠成功依據(jù)。合籠成功后飼喂氧化乳蛋白日糧，以未做氧化修飾的乳蛋白制備空白對(duì)照組飼料；飼養(yǎng)3周后，繁殖產(chǎn)生子代小鼠，持續(xù)飼喂哺乳期雌性小鼠氧化乳蛋白日糧3周，子代小鼠斷乳，隔離并對(duì)各組子代小鼠進(jìn)行組織樣本采集。各組日糧乳蛋白含量相同，配方見(jiàn)表1(日糧配方按照GB 14924.3—2001《小鼠繁殖飼料營(yíng)養(yǎng)成分》要求配制)。各組小鼠同室分籠飼養(yǎng)，保持衛(wèi)生清潔、自由飲食、飲水，溫度(23±2)℃，濕度60%，自然光照。

背景介紹：2018年11月14日，邢福義先生《寄父家書(shū)》出版座談會(huì)在北京商務(wù)印書(shū)館文津廳召開(kāi)。邢先生的老朋友陳章太、戴慶廈、商務(wù)印書(shū)館總經(jīng)理于殿利、華中師范大學(xué)原副校長(zhǎng)黃永林、華中師范大學(xué)北京校友會(huì)會(huì)長(zhǎng)李宇明、《光明日?qǐng)?bào)》國(guó)學(xué)版主編梁樞等出席，陸儉明、張振興、周海清、田小琳等知名學(xué)者發(fā)來(lái)視頻或書(shū)面發(fā)言。座談會(huì)由商務(wù)印書(shū)館總編輯周洪波主持。

表1 孕哺期雌性小鼠日糧配方Tab.1 Diet formulation of female mice during gestation and lactation

1.3.4組織樣本的采集

子代小鼠禁食12 h，稱重，乙醚輕微麻醉，立即解剖，腹主動(dòng)脈取血，將所取血液置于預(yù)先用肝素鈉處理的離心管內(nèi)，-80 ℃保存、待測(cè)。然后取小鼠的腸、肝、腎、腦稱重，將所取出的各組織于冰浴條件下加入生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿液，-80 ℃保存，用于測(cè)定氧化還原指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪含量對(duì)牛乳中蛋白質(zhì)氧化的影響

羰基是蛋白質(zhì)氧化的一個(gè)比較顯著變化，而且相對(duì)來(lái)說(shuō)較易測(cè)量[13]。蛋白質(zhì)的變性作用會(huì)導(dǎo)致羰基含量的升高，且在氧化過(guò)程中，蛋白質(zhì)羰基化的產(chǎn)生是不可逆的[14-15]。一般情況下蛋白質(zhì)中羰基衍生物形成主要有以下4個(gè)途徑[16]: 1、肽骨架的斷裂; 2、氨基酸側(cè)鏈的直接氧化; 3、結(jié)合非蛋白羰基化合物; 4、與還原糖發(fā)生反應(yīng)。有研究表明，氨基酸側(cè)鏈易受自由基攻擊產(chǎn)生，氨基酸殘基氧化形成的羰基會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能喪失[17-19]，所以羰基被廣泛用于測(cè)量不同氧化作用下, 蛋白質(zhì)損傷的程度。

對(duì)脂肪含量不同的牛乳進(jìn)行氧化修飾，凍干乳粉的乳蛋白中羰基含量結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，與未經(jīng)加熱氧化的空白對(duì)照組牛乳相比，經(jīng)氧化修飾后全脂組和低脂組乳蛋白的羰基含量升高；全脂組和低脂組相比，低脂組羰基的含量低于全脂組。結(jié)果表明，不同脂肪含量的乳蛋白氧化都會(huì)導(dǎo)致乳中羰基含量變化，脂肪含量越高，乳中羰基含量越高。

**表示差異極顯著P<0.01。圖1 脂肪含量對(duì)牛乳氧化修飾蛋白中羰基含量的影響Fig.1 Effect of fat content on carbonyl content in oxidized milk protein

蛋白質(zhì)中的巰基基團(tuán)是十分活潑的，且具有很高的抗氧化活性。吳伶艷等[20]等證實(shí)了經(jīng)過(guò)MDA氧化修飾后，大豆蛋白中的巰基減少、羰基化合物增加，且經(jīng)電泳實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過(guò)MDA 氧化修飾后大豆蛋白發(fā)生聚集現(xiàn)象，使得大豆蛋白溶解度出現(xiàn)顯著性下降。對(duì)脂肪含量不同的牛乳進(jìn)行氧化修飾，乳蛋白中巰基含量結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，不同脂肪含量的乳蛋白經(jīng)氧化修飾后，與空白組對(duì)比，全脂組和低脂組乳蛋白的巰基含量明顯下降(P<0.05)；全脂組和低脂組相比，全脂組巰基含量比低脂組低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同脂肪含量的乳蛋白氧化都會(huì)影響巰基的變化，且隨著脂肪含量上升，乳蛋白中巰基含量越低。結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[10]。

*表示與空白組對(duì)比差異顯著P<0.05。 圖2 脂肪含量對(duì)牛乳氧化修飾蛋白中巰基含量的影響Fig.2 Effect of fat content on sulfhydryl content in oxidized milk protein

2.2 孕哺期攝入氧化乳蛋白的影響

2.2.1對(duì)子代小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的影響

經(jīng)過(guò)對(duì)子代小鼠腸、肝、腎和腦中的MDA與HNE測(cè)量，與飼喂未添加氧化乳蛋白日糧的雌性小鼠相比，發(fā)現(xiàn)MDA和HNE在子代小鼠體內(nèi)積累，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖3和圖4。與空白對(duì)照組(飼喂未添加氧化乳蛋白日糧的雌性小鼠)相比，飼喂添加氧化乳蛋白日糧的全脂組與低脂組MDA和HNE含量明顯升高；全脂組與低脂組相比，全脂組MDA和HNE含量比低脂組高。這表明隨著脂肪含量的升高，MDA和HNE在機(jī)體內(nèi)聚集越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在孕哺期攝食氧化修飾不同脂肪含量乳蛋白日糧后，子代小鼠機(jī)體受到明顯的損傷。

*表示與空白組對(duì)比差異顯著P<0.05。圖3 孕哺期飼喂含氧化乳蛋白乳粉日糧對(duì)子代 小鼠組織中MDA含量的影響Fig.3 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on MDA content in tissues of offspring mice during gestation and lactation

*表示與空白組對(duì)比差異顯著P<0.05，** 表示差異極顯著P<0.01。圖4 孕哺期飼喂含氧化乳蛋白乳粉日糧對(duì)子代 小鼠組織中HNE含量的影響Fig.4 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on HNE content in tissues of offspring mice during gestation and lactation

2.2.2對(duì)子代小鼠體內(nèi)氧化還原酶活力的影響

在一般情況下，機(jī)體體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)能抑制自由基的產(chǎn)生，維持細(xì)胞正常的生理功能。常見(jiàn)的機(jī)體內(nèi)氧化還原酶有CAT、SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。

CAT是一類以過(guò)氧化氫為專一底物的酶，存在于動(dòng)物的各個(gè)組織中，尤其是在肝臟中。它能促使自由基上的電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，而且使其分解成氧和水，進(jìn)而抵御自由基傷害機(jī)體。

*表示與空白組對(duì)比差異顯著P<0.05，** 表示差異極顯著P<0.01。圖5 孕哺期飼喂含氧化乳蛋白乳粉日糧對(duì)子代 小鼠組織中CAT活性的影響Fig.5 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on CAT activity in tissues of offspring mice during gestation and lactation

SOD在抑制機(jī)體氧化防御系統(tǒng)中起到了非常重要的作用。機(jī)體抵御自由基的第一防線是SOD，在超氧陰離子產(chǎn)生后，其產(chǎn)生的連鎖反應(yīng)會(huì)損害機(jī)體的細(xì)胞。通過(guò)在孕哺期飼喂氧化乳蛋白日糧3周，經(jīng)過(guò)對(duì)子代小鼠腸、肝、腎和腦中的CAT與SOD測(cè)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖5、圖6。與空白組相比，全脂組與低脂組的各組織中CAT和SOD含量明顯下降；全脂組與低脂組相比，全脂組的CAT和SOD比低脂組含量低；說(shuō)明隨著脂肪含量的升高，機(jī)體中CAT和SOD的含量明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明孕哺期飼喂經(jīng)氧化修飾不同脂肪含量乳蛋白日糧后，子代小鼠腸、肝、腎和腦的氧化還原酶活力均有不同程度的降低。

*表示與空白組對(duì)比差異顯著P<0.05，** 表示差異極顯著P<0.01。圖6 孕哺期飼喂含氧化乳蛋白乳粉日糧對(duì)子代 小鼠組織中SOD活性的影響Fig.6 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on SOD activity in tissues of offspring mice during gestation and lactation

3 結(jié) 論

孕期和哺乳期是子代各組織器官發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，該時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)變化尤其是作為生命物質(zhì)基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)對(duì)后期嬰幼兒的整體發(fā)育有密切的聯(lián)系。研究結(jié)果表明氧化修飾不同脂肪含量乳蛋白中羰基和巰基的含量產(chǎn)生了變化，在雌性小鼠孕哺期攝入氧化修飾脂肪含量不同的乳蛋白后，子代小鼠也受到了影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與未經(jīng)加熱氧化的牛乳相比，全脂組與低脂組羰基含量升高，巰基含量降低。孕哺期飼喂氧化修飾不同脂肪含量乳蛋白日糧后，子代小鼠氧化還原酶活力降低、MDA和HNE在子代小鼠體內(nèi)積累。說(shuō)明孕哺期攝入氧化修飾脂肪含量不同的乳蛋白會(huì)引發(fā)子代小鼠氧化還原狀態(tài)的改變，且脂肪含量越高，狀態(tài)改變?cè)矫黠@。原因可能是脂肪氧化產(chǎn)生大量自由基，從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化；另外，脂肪氧化產(chǎn)生的大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物也會(huì)攻擊蛋白質(zhì)，引起蛋白質(zhì)的氧化[24]，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物在機(jī)體積累從而引起子代小鼠的氧化還原狀態(tài)失衡[25-27]。為避免這種狀態(tài)的發(fā)生，在乳制品加工中，可以考慮通過(guò)將乳脂肪與乳蛋白分離來(lái)降低因氧化造成的乳制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的損失。本研究可以為了解不同脂肪含量乳蛋白對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響以及對(duì)孕哺期的飲食提供一定的理論依據(jù)，但脂肪對(duì)蛋白質(zhì)氧化影響及對(duì)子代機(jī)體影響的相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。