步 營，王 飛，朱文慧,*，勵(lì)建榮，李學(xué)鵬,*，王明麗，郭曉華，勞敏軍

(1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心， 遼寧 錦州 121013；2.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司， 山東 煙臺(tái) 265600； 3.山東美佳集團(tuán)有限公司， 山東 日照 276800；4.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司， 浙江 舟山 316120)

風(fēng)味是食物刺激味覺和嗅覺受體而產(chǎn)生的綜合生理反應(yīng)，是評價(jià)食品品質(zhì)的重要指標(biāo)。水產(chǎn)品中風(fēng)味物質(zhì)的種類有很多，已經(jīng)被鑒定出的呈味物質(zhì)包括游離氨基酸、低聚糖、有機(jī)酸、核苷酸及其關(guān)聯(lián)化合物等滋味成分和揮發(fā)性風(fēng)味成分，這些物質(zhì)相互作用，表現(xiàn)出對比、變調(diào)、相乘、消殺作用和氣味的累加、協(xié)同、融合、掩蓋等，共同產(chǎn)生了獨(dú)特的水產(chǎn)品風(fēng)味[5]。由于在?；钋皶吼B(yǎng)停食，饑餓、低溫使魚體產(chǎn)生了一些應(yīng)激反應(yīng)，魚體消耗了部分儲(chǔ)備的能量物質(zhì)，基本營養(yǎng)成分發(fā)生了變化，同時(shí)魚肉風(fēng)味也出現(xiàn)了一定的變化。目前，已經(jīng)開展了石斑魚[5-6]、大黃魚[7]、大菱鲆[8]、花鱸[9]、鯽魚[9-12]、海鱸魚[13]等水產(chǎn)品在無水?；钸^程中的生理生化變化及脅迫機(jī)制的研究，但針對魚類無水?；钸^程中的風(fēng)味特征變化規(guī)律報(bào)道還較少，有待進(jìn)一步的深入研究。

珍珠龍膽石斑魚常采用無水?；罘绞竭M(jìn)行運(yùn)輸，本研究擬以珍珠龍膽石斑魚為研究對象，探討其在低溫?zé)o水保活過程中呈味成分的變化規(guī)律，希望為珍珠龍膽石斑魚?；钸\(yùn)輸中滋味品質(zhì)保持與提升提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珍珠龍膽石斑魚，購自錦州市林西路水產(chǎn)市場。挑選健康無疾病，體表完好的石斑魚作為實(shí)驗(yàn)樣品，質(zhì)量為(800±50)g，充氧(純氧)運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后，將其放入配置的人工海水中，水溫為(22±0.5)℃，溶氧為6 mg/mL，鹽度為2.7%±0.2%，暫養(yǎng)24 h以消除應(yīng)激反應(yīng)。

磷酸二氫鉀，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乳酸、琥珀酸、檸檬酸、腺嘌呤核糖核苷酸(adenosine monophosphate，AMP)、次黃嘌呤核苷酸(inosinemonphosphate，IMP)、鳥嘌呤核苷酸(guanosine monophosphate，GMP)，均為色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸，分析純，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，德國西格瑪公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS105DU型電子分析天平、PE28型pH計(jì)，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；L- 8900型氨基酸分析儀，日本日立公司；SA- 402B型電子舌，日本Insent公司；C18型液相色譜柱，美國安捷倫公司；Biofuge Stratos型高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

珍珠龍膽石斑魚停食暫養(yǎng)24 h后，以2 ℃/h速率勻速降溫至14 ℃，迅速將魚撈出，放入自封袋中，充入純氧后，封口，置于15 ℃生化培養(yǎng)箱中保存，分別于0、3、6、9、12 h取樣一次。取樣時(shí)采用木棒擊打頭部致死，采集其肌肉組織，隨后將其放入-80 ℃冰箱保存，以便后期指標(biāo)測定。

1.3.1電子舌分析

參照祝倫偉[14]的方法稍做修改。準(zhǔn)確稱取5.0 g石斑魚肉放在100 mL小燒杯中，加入95 mL蒸餾水，高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，稀釋3倍，用0.45 μm濾膜過濾備用。取70 mL過濾后的樣品液于測試杯中，使用電子舌傳感器C00、AE1、AAE、CA0和CT0在室溫下對樣品的苦味、苦味回味、澀味、澀味回味、鮮味、酸味、豐富度和咸味分別進(jìn)行分析。

1.3.2核苷酸測定

參考祝倫偉[14]的方法略有修改。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將AMP、IMP、GMP 3種核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL等系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線依次為：y=22 711x+410(R2=0.997)，y=36 672x-73.945(R2=0.998)，y=40 474x-118.25(R2=0.997)。

樣品前處理：取5 g石斑魚魚肉，絞碎，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的高氯酸溶液，勻漿后在4 ℃條件下4 500 r/min離心10 min，取上清液。沉淀中再次加入10 mL高氯酸，再次勻漿離心(條件同上)。將兩次得到的上清液合并后搖勻，用5 mol/L的KOH調(diào)節(jié)pH值至6.75，過0.22 μm濾膜。

色譜條件：C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為pH值為4.3的0.05 mol/L的KH2PO4-甲醇溶液，進(jìn)樣前超聲10～15 min脫氣；流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，紫外檢測器波長為254 nm。采用梯度洗脫，程序?yàn)?～10 min，KH2PO4與甲醇的體積比為97.5∶2.5；10～17 min，KH2PO4與甲醇的體積比為85∶15；17～20 min，KH2PO4與甲醇的體積比為97.5∶2.5。

1.3.3有機(jī)酸測定

參考楊婉琳[15]的方法略有修改。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(包含乳酸、檸檬酸和琥珀酸等3種有機(jī)酸)配制成0.01、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；將標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同的液相條件下分別進(jìn)樣，以峰面積與對應(yīng)的質(zhì)量濃度(mg/mL)繪制3種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。3個(gè)有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線依次為：y=572.47x-4.496 2(R2=0.999)，y=714.2x+7.466 9(R2=0.993)，y=1 513.6x-30.767(R2=0.997)。

樣品前處理：取5 g石斑魚魚肉，絞碎后加入15 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的高氯酸溶液，高速均質(zhì)機(jī)勻漿后靜置20 min，4 ℃、7170 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待高效液相色譜進(jìn)樣分析。

色譜條件：C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)，柱溫為25 ℃；檢測器為紫外吸收檢測器，檢測波長為205 nm；流動(dòng)相為甲醇與KH2PO4(0.01 mol/L, pH值為2.8，二者體積比為5∶95)，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，等梯度洗脫。

1.3.4游離氨基酸測定

參考鄧婕春等[16]的測定方法并修改。準(zhǔn)確稱取魚肉樣品3 g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸50 mL，均質(zhì)后靜置2.5 h，12 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min。取5 mL上清液，用3 mol/L NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)至2.0～2.5，加入蒸餾水定容至10 mL，搖勻后靜置10 min，過0.45 μm濾膜得到待測液。

氨基酸自動(dòng)分析儀的條件設(shè)置：分離柱溫度為57 ℃，檢測波長為570 nm，緩沖溶液流速為0.4 mL/min；反應(yīng)液為茚三酮試劑，反應(yīng)液流量為0.35 mL/min；反應(yīng)單元溫度為135 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用Origin Pro 9.0軟件繪制曲線圖，SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。顯著性分析采用Duncan多重比較法，P<0.05表示差異顯著，數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斑魚無水?；钸^程中電子舌分析結(jié)果

電子舌或味覺傳感器是用來確定感官屬性最常用的工具之一[17]。表1是樣品按體積比稀釋30倍后電子舌的測定結(jié)果。由表1可知，樣品中的酸味、澀味、咸味均為負(fù)數(shù)，表明其無法被人類味覺所感知，而苦味和濃厚味的響應(yīng)值明顯高于其他滋味。鮮樣具有較高的苦味和苦味余味響應(yīng)值，并且鮮味和澀味余味的響應(yīng)值較低。無水保活后，與對照組相比，在0～3 h時(shí)，鮮味值顯著增加至最大值4.13。這可能是因?yàn)槭唪~在短時(shí)間降溫后，魚體為適應(yīng)低溫環(huán)境，通過積聚氨基酸抵抗冷脅迫，親水性氨基酸，如天冬氨酸、蘇氨酸和絲氨酸能使機(jī)體中的結(jié)合水含量增加，有助于應(yīng)對低溫[18]；而天冬氨酸為鮮味氨基酸，蘇氨酸、絲氨酸屬于甜味氨基酸，能夠降低苦味，增加鮮味。?；?～12 h后，鮮味值逐漸緩慢降低，12 h后降為3.52，但仍高于鮮樣。這可能是因?yàn)殡S保活時(shí)間延長，石斑魚再次產(chǎn)生脅迫反應(yīng)，體內(nèi)代謝再次發(fā)生變化，產(chǎn)生一定量的多肽，以及不同呈味氨基酸含量發(fā)生變化，因而表現(xiàn)為鮮味增加、苦味降低。在12 h后，濃厚味值增加至最大值，為5.00。

表1 不同保活時(shí)間后珍珠龍膽石斑魚魚肉電子舌分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of electronic tongue of pearl gentian grouper with different keeping alive time

圖1為電子舌PCA分析結(jié)果，由圖1可知，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為68.22%和22.07%，累積貢獻(xiàn)率為90.29%，因此，PC1和PC2包含了大量信息，可以反映樣本的總體特性。圖1中所有樣品的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)分散，0 h與其余各組距離較遠(yuǎn)，鮮樣與3、6 h距離較為接近，9 h與12 h較為接近，結(jié)合表1數(shù)據(jù)可以表明，?；? h之后，石斑魚魚肉的滋味得到較大改善，12 h后其濃厚味最佳。

圖1 不同?；顣r(shí)間后珍珠龍膽石斑魚魚肉的電子舌PCA分析結(jié)果Fig.1 Electronic tongue PCA analysis results of pearl gentian grouper with different keeping alive time

2.2 石斑魚無水?；钸^程中核苷酸含量變化

鮮味被定義為谷氨酸引起的特征味覺，研究表明，AMP、IMP、GMP等核苷酸也能提供一定的鮮味。此外，還發(fā)現(xiàn)核苷酸和鮮味氨基酸之間存在協(xié)同作用，當(dāng)它們以一定的比例混合時(shí)能產(chǎn)生更強(qiáng)烈的鮮味[19-20]。IMP、GMP和AMP是魚肉中的3種主要呈味核苷酸，其中IMP和AMP可以通過ATP的分解產(chǎn)生。在生物體內(nèi)，IMP有兩種轉(zhuǎn)化方式：一部分會(huì)參與能量循環(huán)，轉(zhuǎn)變成運(yùn)輸能量的物質(zhì)ATP，為細(xì)胞活動(dòng)提供能量；另一部分在酶的作用下進(jìn)一步分解為GMP和AMP，為DNA的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。無水保活后，魚肉中的核苷酸變化如表2。表2顯示：隨著無水?；畹臅r(shí)間增加，IMP含量隨?；顣r(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(P<0.05)，在保活3 h后含量達(dá)到最大值(465.0 mg/100g)；AMP含量無顯著變化；GMP是IMP轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，GMP在?；钇陂g也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，?；钋捌?，石斑魚為抵抗低溫，消耗的ATP較多，而IMP降解速度較慢，造成IMP的積累；保活后期，IMP含量的降低一方面可能是由于石斑魚在保活后期新陳代謝速率降低，能量消耗較少，分解的ATP較少[21]，另一方面，可能是無水?；顚?dǎo)致魚體內(nèi)的堿性磷酸酶活性上升，導(dǎo)致IMP降解增加[22-23]。滋味活性值(taste active value, TAV)是滋味物質(zhì)濃度與該物質(zhì)的閾值的比值。TAV反映了單一化合物對滋味的貢獻(xiàn)，TAV小于1表示該物質(zhì)對滋味貢獻(xiàn)不大，TAV大于1表示該物質(zhì)對滋味貢獻(xiàn)較大，且數(shù)值越大，貢獻(xiàn)越大。各處理組IMP的TAV均大于1，說明IMP對珍珠龍膽石斑魚的滋味有重要貢獻(xiàn)。經(jīng)保活12 h后，與鮮樣相比，IMP的含量降低了60%，其TAV降低至7.20。?；?2 h后，核苷酸總量顯著下降，比?；钋敖档土?8.59%。本研究表明，無水?；畈焕谑唪~核苷酸類呈味物質(zhì)的積累。

表2 不同?；顣r(shí)間后珍珠龍膽石斑魚魚肉的核苷酸含量變化Tab.2 Changes in nucleotide content of pearl gentian grouper with different keeping alive time mg/100 g

2.3 石斑魚無水?；钸^程中有機(jī)酸含量變化

有機(jī)酸具有一定的呈味作用，檸檬酸略帶果香的酸味，琥珀酸呈現(xiàn)出酸鮮味，乳酸具有爽口的酸味。檸檬酸是有機(jī)酸中的第一大酸，琥珀酸與檸檬酸、谷氨酸鈉或氯化鈉等具有協(xié)同增鮮的作用，能顯著增強(qiáng)鮮味。表3為不同?；顣r(shí)間后珍珠龍膽石斑魚魚肉的有機(jī)酸含量變化情況。由表3可以看出，魚肉中乳酸含量顯著增加，這可能是在無水?；钸^程中，魚體的有氧呼吸受到抑制，無氧呼吸增強(qiáng)，從而導(dǎo)致乳酸在肌肉中積累，這與丁亞濤等[24]對鳊魚無水?；畹难芯拷Y(jié)論一致。魚肉中檸檬酸含量在保活后均呈先增加后降低的趨勢，琥珀酸含量呈現(xiàn)出先降低后增高的趨勢。琥珀酸及檸檬酸均為三羧酸循環(huán)的中間物質(zhì)，正常情況下，其變化不大，而當(dāng)有氧呼吸被抑制時(shí)，兩種有機(jī)酸含量會(huì)受到一定的影響。在?；钋捌?，魚體因冷脅迫，通過加強(qiáng)代謝御暖抗寒，此時(shí)有氧呼吸相對旺盛；?；詈笃?，可能由于包裝袋內(nèi)二氧化碳的積累，抑制了魚體有氧呼吸，從而導(dǎo)致魚體通過無氧呼吸為機(jī)體提供能量[25]。各處理組魚肉中乳酸含量差異顯著(P<0.05)，保活12 h后乳酸達(dá)到最大值，為158.70 mg/g，是鮮樣的1.40倍。?；?.2 h后，琥珀酸和檸檬酸含量分別增加了11.2%和12.7%，與周翠平[26]研究結(jié)果一致。各處理組琥珀酸、乳酸和檸檬酸的TAV值均大于1，說明3種有機(jī)酸對石斑魚的滋味有重要貢獻(xiàn)。無水保活后，魚肉中有機(jī)酸總量增加，表明其鮮味比?；钋坝兴黾樱瑢︳~肉的滋味有一定的改善。

表3 不同保活時(shí)間后珍珠龍膽石斑魚魚肉的有機(jī)酸含量變化Tab.3 Changes in organic acid content of pearl gentian grouper with different keeping alive time

2.4 石斑魚無水?；钸^程中游離氨基酸含量變化

魚肉中的氨基酸種類及含量與捕魚的季節(jié)以及飼料中的成分有關(guān)[28]，通常情況下認(rèn)為魚肉經(jīng)過處理或者貯藏后，其游離氨基酸的含量及組成會(huì)發(fā)生較大變化。表4是石斑魚徑無水保活后在不同時(shí)間的游離氨基酸含量的變化情況。由表4可知，丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸經(jīng)冰溫處理后有顯著升高(P<0.05)。鮮味氨基酸中谷氨酸、天冬氨酸變化較大，呈先上升后下降的趨勢，?；? h達(dá)到最大值，含量分別為41.50、7.29 mg/100 g，顯著高于鮮樣的8.54、0.60 mg/100 g。甜味氨基酸中丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的平均值較鮮活魚大幅提高。與鮮樣組相比，休眠處理組魚肉中的游離氨基酸總量(total free amino acid, TFAA)和必需氨基酸(essential amino acid, EAA)分別是保活前的3.70倍和3.04倍，說明無水?；詈笫唪~肉蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值得到提升。石斑魚中具有甜味的氨基酸含量相對較高，是主要呈味成分。無水?；詈?，甜味氨基酸(SAA)與苦味氨基酸(BAA)含量呈先上升后下降的趨勢，?；詈笃浜糠謩e是?；钋暗?.19倍和2.38倍；鮮味氨基酸(DAA)含量是保活前的1.81倍，其中丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和賴氨酸無水?；詈箫@著增加，除賴氨酸呈苦味，其他3種氨基酸均呈甜味，這表明無水?；钣欣隰~體內(nèi)游離氨基酸含量的提升，且使得魚肉的鮮甜滋味得到改善。牙鲆在低溫?zé)o水?；?0 h后，天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和精氨酸下降程度超過10%，而胱氨酸則增加了27.3%[29]；鱘魚低溫?；钸^程中，游離氨基酸態(tài)氮含量先上升后下降，在12 h達(dá)到最大值，與本研究中魚肉的游離氨基酸變化趨勢一致。在低溫脅迫下，蛋白質(zhì)會(huì)被水解為各種氨基酸，為抗應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)的合成與周轉(zhuǎn)提供原料，同時(shí)起到抗應(yīng)激的功能[30]。在低溫?zé)o水條件下，游離氨基酸增加可能是因?yàn)轸~體通過分解蛋白質(zhì)獲得能量及調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝抵抗寒冷，從而增強(qiáng)自身的抗寒能力。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，無水?；钸^程對石斑魚的滋味有較大影響，乳酸、琥珀酸、乳酸和檸檬酸等滋味成分對珍珠龍膽石斑魚的滋味有重要貢獻(xiàn)。經(jīng)無水?；詈螅~肉中有機(jī)酸總量和呈鮮味、甜味的游離氨基酸含量均顯著增加；而呈味核苷酸含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。經(jīng)無水?；詈?，魚肉總體呈現(xiàn)出鮮味先增加后降低的趨勢，但仍高于鮮樣，苦味呈先增加后降低的趨勢，但仍低于鮮樣；濃厚味呈增加的趨勢，這是魚肉中的核苷酸、有機(jī)酸及游離氨基酸共同呈味作用的結(jié)果。無水?；詈?，有機(jī)酸和游離氨基酸含量的增加，不僅有利于魚肉滋味的改善，同時(shí)也提高了魚肉的營養(yǎng)價(jià)值，這表明無水?；钐岣吡唆~肉的品質(zhì)，有利于魚肉的進(jìn)一步加工。

表4 不同?；顣r(shí)間后珍珠龍膽石斑魚魚肉游離氨基酸含量變化Tab.4 Changes in free amino acid content of pearl gentian grouper with different keeping alive time mg/100 g