吳旭龍 朱路路 楊佳磊 徐冰一 趙直 古聯(lián) 蘇莉*

1 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧市 530021；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科，南寧市 530023

缺血性腦卒中是由于腦動脈狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致患者腦組織壞死的總稱，約占全部腦卒中的85%；腦卒中是全球人群死亡的第二大疾病原因[1]。circRNA(Circular RNA，環(huán)形RNA分子)是一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴，并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。哺乳動物的大腦中存在豐富的circRNA，參與調(diào)節(jié)機體許多病理生理過程，包括腦缺血損傷、神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)可塑性等[2]。發(fā)生腦缺血后，機體hsa_circRNA_104600的親本基因VDAC3表達(dá)水平下降，使VDAC3蛋白水平保持穩(wěn)定，有助于保護線粒體，改善機體神經(jīng)功能[3]。本研究探討了外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平與急性缺血性腦卒中的關(guān)系，旨為探尋缺血性腦卒中的分子治療靶點提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年8月至2019年9月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性缺血性腦卒中患者45例作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1995 年中華醫(yī)學(xué)會第四次全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點(1995)》[4]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)頭顱 CT和/或 MRI 檢查確診；發(fā)病在72 h以內(nèi)；患者之間無血緣關(guān)系；患者或其家屬簽署檢測研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：由短暫性腦缺血發(fā)作、動脈炎、腦外傷、腫瘤、血液病、腦血管畸形、藥物等其他原因引起的缺血性腦卒中；合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全或造血功能障礙；合并嚴(yán)重免疫系統(tǒng)或感染性疾病。根據(jù)《美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表》(NIHSS)[5]評分，將納入研究的患者分為輕度神經(jīng)功能缺損組(<5分)、中重度神經(jīng)功能缺損組(≥5分)。選擇同期在南寧市青秀區(qū)2家社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心參加健康體檢的健康志愿者45人為對照組。兩組研究對象的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會及廣西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)。

表1 兩組研究對象的性別、年齡比較 (n，x±s)

1.2 方法

1.2.1 外周血circRNA表達(dá)水平檢測 收集患者入院時和健康者體檢時空腹靜脈血5 mL儲存于乙二胺四乙酸抗凝管，采用qRT-PCR技術(shù)檢測hsa_circRNA_104600的表達(dá)水平。使用試劑：(1)TRIzol試劑(美國 Invitrogen公司)；(2)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；(3)TB Green? Premix Ex TaqTMII[寶生物工程(大連)有限公司]。hsa_circRNA_104600和內(nèi)參基因β-actin的引物序列見表2。

表2 hsa_circRNA_104600和β-actin的qRT-PCR引物序列

嚴(yán)格按照試劑說明書進行檢測操作，運用TRIzol試劑提取研究對象外周血的RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(美國ABI)、qRT-PCR技術(shù)檢測hsa_circRNA_104600的表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s預(yù)變性；95℃ 5 s變性；60℃ 34 s退火、延伸40個循環(huán)，具體細(xì)節(jié)參照試劑說明書。

在qRT-PCR實驗結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，獲得每個樣本的CT值，單個樣本的△CT=(該樣本的hsa_circRNA_104600的平均CT值)-(該樣本的β-actin的平均CT值)，以2-△CT計算hsa_circRNA_104600的相對表達(dá)水平。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評價 在患者入院后即對其神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度進行評價。由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的神經(jīng)內(nèi)科住院醫(yī)師對患者進行NIHSS 量表評分[5]，評分越高表示患者的神經(jīng)功能缺損程度越嚴(yán)重。

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較病例組患者和對照組健康志愿者外周血hsa_circRNA_104600的表達(dá)水平；(2)繪制根據(jù)hsa_circRNA_104600水平診斷急性缺血性腦卒中的ROC曲線；(3)比較輕度神經(jīng)功能缺損組與中重度神經(jīng)功能缺損組患者外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用R語言(R Version 3.6.3)統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗；計數(shù)資料以%表示，比較采用χ2檢驗。繪制根據(jù)hsa_circRNA_104600水平診斷急性缺血性腦卒中的ROC曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病例組和對照組的外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平比較 病例組急性缺血性腦卒中患者的外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平顯著高于對照組健康志愿者(W=587.500，P<0.05)。繪制ROC曲線，根據(jù)hsa_circRNA_104600外周血表達(dá)水平診斷急性缺血性腦卒中的ROC曲線下面積(AUC)為0.725、靈敏度為0.933、特異度為0.533。見圖1、圖2。

圖1 病例組和對照組外周血 hsa_circRNA_104600表達(dá)水平比較

2.2 不同神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度患者的外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平比較 中重度神經(jīng)功能缺損組急性缺血性腦卒中患者的外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平顯著高于輕度神經(jīng)功能缺損組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(W=129.407，P=0.049)。見圖3。

圖3 不同神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度患者的外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平比較

3 討 論

circRNA在人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)，在阿爾茲海默癥、帕金森病和多發(fā)性硬化癥等疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[6]。Han等[7]報道，中動脈閉塞中風(fēng)模型小鼠的大腦組織和缺血性腦卒中患者血漿中的circHectd1表達(dá)水平均顯著升高，而敲除circHectd1可以縮小中動脈閉塞中風(fēng)模型小鼠的梗死面積、減輕其神經(jīng)元損傷。Bai等[8]報道，缺血性腦卒中患者血漿中的circDLGAP4表達(dá)水平顯著降低；而circDLGAP4過表達(dá)可減輕腦卒中模型小鼠的神經(jīng)功能缺損、減少梗死面積、減輕血腦屏障損傷。由此可見，circRNA可能在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Zuo等[9]通過檢測200例急性缺血性腦卒中患者和100例健康對照者血漿中的circFUNDC1, circPDS5B和circCDC14A表達(dá)水平，繪制了根據(jù)這3個環(huán)狀RNA分子聯(lián)合診斷急性缺血性腦卒中的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AUC為0.875，診斷的靈敏度為0.715、特異度為0.910。因此認(rèn)為，circFUNDC1, circPDS5B和circCDC14A表達(dá)水平可作為診斷急性缺血性腦卒中的生物學(xué)標(biāo)志物。 本研究結(jié)果顯示，根據(jù)hsa_circRNA_104600水平診斷急性缺血性腦卒中的AUC值為0.725，靈敏度為 0.933，特異度為0.533，與前述文獻報道的結(jié)果相似。

hsa_circRNA_104600位于8號染色體42259305- 42260979上，其親本基因VDAC3編碼的蛋白屬于線粒體孔蛋白家族，可能參與了腺嘌呤核苷酸的易位并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡可能是缺血性腦卒中后機體神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因[10-11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些外周血非編碼RNA的表達(dá)水平與急性缺血性腦卒中患者的NIHSS評分顯著相關(guān)，NHISS評分常用于評估腦卒中患者病情的嚴(yán)重程度，由此可以推測患者外周血非編碼RNA的表達(dá)水平可能對其病情的嚴(yán)重程度產(chǎn)生影響[12]。Chen等[13]報道，lncRNA HULC 與急性缺血性腦卒中患者的NHISS評分呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.456)，因此推測其可能結(jié)合miR-9后會抑制神經(jīng)細(xì)胞的再生，從而增加患者腦卒中后的神經(jīng)損傷。Peng等[14]報道，circRNA HECTD1和急性缺血性腦卒中患者NHISS評分呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.462)，推測其可能會競爭性結(jié)合miR-142，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，擴大梗死面積，從而加重急性缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損程度。本研究結(jié)果顯示，急性缺血性腦卒中患者的外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平顯著高于對照組健康志愿者，中重度神經(jīng)功能缺損組患者的外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平顯著高于輕度神經(jīng)功能缺損組患者。由此可以推測，hsa_circRNA_104600可能會通過競爭性結(jié)合miR-1246而導(dǎo)致機體大腦缺血再灌注損傷，從而加重急性缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能缺損。

綜上所述，外周血hsa_circRNA_104600表達(dá)水平與急性缺血性腦卒中患者的發(fā)病及其神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度存在比較密切的關(guān)系，可作為潛在的治療靶點。