耿 彬 陳開健* 劉 祥 魏澤宏 易新文 胡 毅** 唐 濤

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，長沙 410128；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點實驗室，長沙 410081；3.深圳市澳華集團(tuán)股份有限公司，深圳 518067)

豆粕因蛋白質(zhì)含量高且氨基酸組成較為均衡而成為水產(chǎn)飼料中重要的蛋白質(zhì)源，但隨著國內(nèi)水產(chǎn)行業(yè)的迅速發(fā)展，豆粕需求量逐年增長，而我國大豆主要依靠進(jìn)口，加之近年來中美貿(mào)易關(guān)系緊張，導(dǎo)致大豆價格持續(xù)走高，因此尋找成本低廉且對養(yǎng)殖動物無負(fù)面影響的替代蛋白質(zhì)源顯得尤為重要。玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)是玉米產(chǎn)出燃料乙醇后，再通過低溫干燥處理形成的含有可溶固形物的干酒糟。玉米DDGS中蛋白質(zhì)、纖維素、維生素和脂肪含量較高，且價格低廉，來源廣泛[1-2]。玉米DDGS在畜禽生產(chǎn)中已有廣泛的研究和應(yīng)用，有研究表明飼糧中添加適量玉米DDGS對動物的生長無不利影響，但在肉雞飼糧中添加水平過高可能會導(dǎo)致雞胸肉產(chǎn)量下降[3]。有研究顯示，玉米DDGS中含有玉米黃質(zhì)及葉黃素，動物攝入后會對肌肉、皮膚或其副產(chǎn)物顏色產(chǎn)生影響[4-5]，例如，在蛋雞飼糧中添加玉米DDGS會對蛋黃的顏色產(chǎn)生顯著影響。

關(guān)于玉米DDGS對水產(chǎn)動物影響的研究多集中在生長和免疫方面，飼料中適量添加玉米DDGS對水產(chǎn)動物的生長性能無負(fù)面影響且能在一定程度上提高機體免疫力[6-7]，但對體色、肉色和腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究未見報道。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕為主要蛋白質(zhì)源，并分別添加0(對照組)、3%(D1組)、6%(D2組)和12%(D3組)的玉米DDGS(主要成分為蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維及有效磷)，配制4種試驗飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料制備前先將飼料原料粉碎，過60目篩，按配比從小到大逐級定量均勻混合，再將其投入V型攪拌機充分混合25 min；隨后將豆油與混好的飼料干粉充分混勻，再噴入適量的水混合均勻，將混合均勻的飼料用單螺桿擠壓式飼料膨化機(安德里茨EX1250，中國，調(diào)制溫度100 ℃，出模溫度120 ℃左右)制成粒徑為3.0 mm的膨化飼料，陰涼處風(fēng)干后儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計與養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗在湖南省婁底市車田江水庫試驗基地中進(jìn)行，試驗魚統(tǒng)一購于種苗公司，并在網(wǎng)箱(9 m×9 m×2 m)中暫養(yǎng)1個月，暫養(yǎng)期間投喂對照組飼料，分組前饑餓24 h。挑選規(guī)格一致、體格健康、初始體重(50.0±0.2)g的斑點叉尾1 150尾，隨機分配至23個網(wǎng)箱(網(wǎng)箱材料為聚乙烯，規(guī)格為1.5 m×1.5 m×2.0 m，使用前用3%的食鹽水浸泡5～10 min)，每個網(wǎng)箱隨機分配50尾。將23個網(wǎng)箱共分為4個組，即1個對照組和3個試驗組(D1組、D2組、D3組)，對照組分配8個網(wǎng)箱(重復(fù))，每個試驗組均分配5個網(wǎng)箱(重復(fù))。每日分別在06:00、12:00、18:00進(jìn)行投喂，投喂量以魚體重的3%～5%為準(zhǔn)，每周根據(jù)實際情況調(diào)整投喂量。每天早中晚測量并記錄水溫。養(yǎng)殖期間每周測定水體溶氧濃度以及pH。養(yǎng)殖期間水體溫度為(26.0±1.2) ℃，pH為7.4～7.8，溶解氧濃度>5 mg/L，氨氮濃度<0.01 mg/L。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 生長性能

存活率(%)=100×試驗?zāi)~尾數(shù)/試驗初魚尾數(shù)；增重率(%)=100×(終末體重-初始體重)/初始體重；飼料系數(shù)=總投喂量/(終末體重+死魚重量-初始體重)；攝食率(%/d)=100×總投喂量/[(初始均重+終末均重)×飼養(yǎng)天數(shù)/2]；特定生長率(%)=100×(ln終末體重-ln初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù)；肝體比(HSI，%)=100×肝臟重/體重；臟體比(VSI，%)=100×內(nèi)臟重/體重；肥滿度(CF，g/cm3)=100×體重/體長3；腹脂率(AFP，%)=100×腹脂重/體重。

1.3.2 體色和肉色

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個網(wǎng)箱中隨機取6尾魚，參考梁高楊等[9]的方法，用色差儀(NR110)測定腹部與側(cè)線附近皮膚的亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)值以及背部肌肉的L*、a*、b*值。具體測樣點如圖1所示。

圖1 體色測樣點(圖片來自百度網(wǎng)站)

1.3.3 血清生化指標(biāo)

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個網(wǎng)箱中隨機取5尾魚，使用經(jīng)0.2%的肝素鈉潤洗后的注射器自尾靜脈取血，儲存于4 ℃冰箱，2 h后使用離心機3 000 r/min離心10 min，吸取血清并保存于-80 ℃冰箱中待測。血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性以及低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽汁酸(total bile acid,TBA)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定，免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、補體3(complement 3，C3)和補體4(complement 4，C4)含量采用浙江伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個網(wǎng)箱中隨機取3尾魚，用于腸道菌群結(jié)構(gòu)檢測樣品采集。將解剖盤與器材用75%酒精消毒后，在酒精燈旁取出魚體腸道后放入無菌離心管，于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)腸道菌群結(jié)構(gòu)分析。使用天根總DNA提取試劑盒進(jìn)行斑點叉尾腸道菌群DNA提取。選取對照組、D2組、D3組DNA送北京諾和致源生物科技有限公司進(jìn)行腸道菌群測序，后續(xù)利用諾和致源售后平臺工具(https://magic.novogene.com)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 25.0軟件采用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較。顯著水平為P<0.05，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾生長性能的影響

由表2可知，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對斑點叉尾的增重率、特定生長率、存活率、飼料系數(shù)、攝食率、肝體比及肥滿度無顯著影響(P>0.05)。D2組的臟體比最高，顯著高于D3組(P<0.05)，與其他組差異不顯著(P>0.05)。D1組的腹脂率最高，顯著高于D2組(P<0.05)，與其他組差異不顯著(P>0.05)。

表2 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾生長性能的影響

2.2 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾皮膚及肌肉色度值的影響

由表3可知，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對斑點叉尾腹部皮膚L*值無顯著影響(P>0.05)，但顯著升高了a*和b*值(P<0.05)。飼料中添加6%和12%的玉米DDGS使側(cè)面皮膚L*值顯著下降(P<0.05)，a*和b*值顯著升高(P<0.05)。各組間背部肌肉L*值無顯著差異(P>0.05)，各試驗組a*和b*值均顯著高于對照組(P<0.05)，且D2組和D3組b*值還顯著高于D1組(P<0.05)。由圖2可以看出，隨著飼料中玉米DDGS添加水平的升高，斑點叉尾肉色有肉眼可見的變黃趨勢。

表3 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾皮膚及肌肉色度值的影響

圖2 斑點叉尾肌肉

2.3 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對斑點叉尾血清IgM、C4及TBA含量無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，D1組血清AKP活性和TC含量顯著升高(P<0.05)，D2組顯著降低(P<0.05)，D3組則無顯著變化(P<0.05)；D2組和D3組血清LDL、TG和C3含量顯著降低(P<0.05)，D1組則無顯著變化(P>0.05)。

表4 飼料中添加不同水平DDGS對斑點叉尾血清生化指標(biāo)的影響

2.4 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)生長性能、血清生化指標(biāo)和體色、肉色差異，對對照組、D2組和D3組腸道菌群進(jìn)行測序。由圖3可知，對照組操作分類單元(OTU)數(shù)目為406個，D2組OTU數(shù)目為424個，D3組OTU數(shù)目為305個，3組共有的OTU數(shù)目為164個，對照組與D2組共有OTU數(shù)目為150個，對照組與D3組共有OTU數(shù)目為31個，D2組與D3組共有OTU數(shù)目為43個，對照組特有OTU數(shù)目為61個，D2組、D3組特有OTU數(shù)目均為67個。

圖3 OTU韋恩圖

2.4.1 門水平結(jié)構(gòu)分析

表5 門水平排名前5的物種相對豐度

Fusobacteria：梭桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；unidentified_Bacteria：未鑒定細(xì)菌；Spirochaetes：螺旋體門；Others：其他。

2.4.2 屬水平結(jié)構(gòu)分析

表6 屬水平排名前3的物種相對豐度

Cetobacterium：鯨桿菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Plesiomonas：鄰單胞菌屬；Macellibacteroides：屠場桿狀菌屬；Pseudogracilibacillus：假纖細(xì)芽胞桿菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；Citrobacter：檸檬酸桿菌屬；Jeotgalicoccus：咸海鮮球菌屬；unidentified_Clostridiales：梭菌目未鑒定屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Others：其他。

3 討 論

3.1 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾生長性能的影響

研究表明，細(xì)鱗鯧(Piaractusmesopotamicus)幼魚飼料中添加玉米DDGS可提高飼料效率，對增重率和形體指標(biāo)無顯著影響[10]。本研究結(jié)果表明，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對斑點叉尾的生長性能無顯著影響，與在草魚(Ctenopharyngodonidellus)[11]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[11]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[6]和金頭鯛(Sparusaurata)[7]幼魚上的研究結(jié)果相似。何曉慶等[12]用玉米DDGS替代奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.mossambicus)飼料中的豆粕后發(fā)現(xiàn)各組臟體比、肝體比均無顯著差異。在本試驗中，飼料中添加不同水平玉米DDGS替代部分豆粕對斑點叉尾的肝體比無顯著影響，但臟體比在添加水平為6%時最高，與在奧尼羅非魚[12]上所得結(jié)果不一致，其原因可能是飼料中植物性蛋白質(zhì)源或脂肪源在一定水平時會導(dǎo)致脂肪在魚體內(nèi)沉積[13-14]，當(dāng)玉米DDGS添加水平達(dá)到6%時，可能影響了斑點叉尾對脂質(zhì)的吸收利用，促進(jìn)脂肪在臟器中沉積，導(dǎo)致臟體比升高。

3.2 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾體色和肉色的影響

魚類的皮膚和肌肉顏色的變化取決于攝取的類胡蘿卜素，魚類和其他動物一樣，自生不能合成類胡蘿卜素[15]。玉米DDGS中含有的玉米黃質(zhì)和葉黃素會影響斑點叉尾皮膚和肌肉的b*值，b*值越大說明顏色越黃。本試驗結(jié)果顯示，飼料中玉米DDGS添加水平的變化未對斑點叉尾腹部皮膚和背部肌肉L*值產(chǎn)生顯著影響，但添加6%和12%玉米DDGS時，各部位皮膚a*值顯著升高，皮膚及肌肉b*值與a*值呈相似的變化趨勢，其可能的原因是玉米DDGS含有較高比例的類胡蘿卜素，且玉米DDGS中葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量是黃色玉米的3倍，而類胡蘿卜素中的葉黃素及玉米黃質(zhì)能夠?qū)е卖~類體色和肉色變黃[16]，這與Li等[17]的研究結(jié)果相似。

3.3 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾血清生化指標(biāo)的影響

血清中LDL、TC、TG和TBA含量是評價動物肝膽健康及脂質(zhì)吸收代謝的重要指標(biāo)，LDL作為膽固醇的載體，其含量與血清中TC含量呈正相關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，隨著飼料中玉米DDGS添加水平的升高，血清中LDL、TC、TG含量均不同程度下降，血清TBA含量各組間無顯著差異，與黃文慶等[18]的研究結(jié)果相似。在亞麻籽飼料中添加玉米DDGS會顯著降低肉雞血清TG和TC含量[19]，說明飼料中添加玉米DDGS能改善脂質(zhì)吸收代謝且不會對肝臟功能造成負(fù)面影響。Shelby等[20]使用玉米DDGS部分替代飼料中豆粕后對尼羅羅非魚(OreochromisniloticusL.)血清免疫指標(biāo)并無顯著影響，本研究中血清IgM和C4含量的結(jié)果與其一致。AKP作為生物體內(nèi)重要的磷酸酶，能夠反映機體肝臟功能是否有損傷[21]。在正常情況下血清中AKP的活性保持在相對較低且穩(wěn)定的狀態(tài)下，只有當(dāng)肝臟受到損傷時其活性才會升高[22]。本研究中，飼料中玉米DDGS添加水平為6%時血清AKP活性顯著低于對照組，添加水平為12%時與對照組差異不顯著，因此推測斑點叉尾攝入含6%或12%玉米DDGS的飼料后未對肝臟功能造成損傷。

3.4 飼料中添加不同水平玉米DDGS對斑點叉尾腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

硬骨魚類與水生環(huán)境直接接觸，因此水環(huán)境中復(fù)雜而動態(tài)的微生物群落可能對其健康產(chǎn)生影響[23]。腸道黏膜表面是腸道菌群與宿主相互作用的主要部位，正常微生物群落在腸道黏膜表面的定植對腸道的消化吸收和機體免疫調(diào)節(jié)功能具有積極作用，而微生物群落失衡對魚體則會產(chǎn)生不利影響[24]。與水環(huán)境相比，消化道是一個營養(yǎng)更豐富的生態(tài)系統(tǒng)，因此更有利于大多數(shù)細(xì)菌的生長，但并不是所有進(jìn)入魚類消化道的食物中的細(xì)菌都會寄生在腸道內(nèi)[25]。存在于消化道中的微生物以寄主的食物為食，寄主的食物被它們和寄主自身產(chǎn)生的酶消化，而寄主產(chǎn)生的食糜決定了消化道中微生物的豐度和質(zhì)量組成[26]，因此飼料的組成成分會對其腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。本試驗研究結(jié)果顯示，斑點叉尾飼料中玉米DDGS添加水平不同不會改變腸道中的絕對優(yōu)勢菌群，其門水平上的梭桿菌門和屬水平上的鯨桿菌屬為其腸道中絕對優(yōu)勢菌群。有研究表明魚類初級腸道菌群的建立取決于卵黃囊階段攝入的細(xì)菌種類，在首次進(jìn)食后保持不變，并在進(jìn)食后數(shù)周至數(shù)月內(nèi)形成穩(wěn)定菌群[27]，這有可能是本研究中不同組斑點叉尾腸道中絕對優(yōu)勢菌群保持不變的原因。通過分析OTU韋恩圖發(fā)現(xiàn)，飼喂添加不同水平玉米DDGS飼料的斑點叉尾共有OTU的數(shù)目為164個，說明不同分組共有一個穩(wěn)定的核心菌群，這與何嬌嬌等[28]在研究發(fā)酵豆粕對大黃魚(Larimichthyscrocea)幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)影響時得出的結(jié)果相似。

在本試驗中，當(dāng)飼料中玉米DDGS添加水平達(dá)到6%時，斑點叉尾腸道內(nèi)門水平的梭桿菌門、擬桿菌門和屬水平的鯨桿菌屬的相對豐度較其他2組有所上升。Qi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度氨會增加鯽魚(Carassiusauratusauratus)免疫相關(guān)基因和抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)，同時腸道中鯨桿菌屬的數(shù)量也會增加，鯨桿菌屬可能屬于能夠提高魚類免疫力的潛在有益菌。在對牛蛙的腸道微生物研究中發(fā)現(xiàn)，鯨桿菌屬能更好地提高氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝率[30]，膳食氨基酸是魚類生長和維持所必需的，特別是處在生長期的幼魚，某些氨基酸及其代謝物是關(guān)鍵代謝途徑的重要調(diào)節(jié)劑，對魚類生長、采食、養(yǎng)分利用、免疫力、行為、幼蟲變態(tài)、繁殖以及對環(huán)境壓力和病原生物的抗性具有重要意義[31-32]。本研究結(jié)果還顯示，在飼料中添加玉米DDGS會提高斑點叉尾腸道中鯨桿菌屬的相對豐度，進(jìn)而改善其腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外，玉米DDGS中富含動物蛋白質(zhì)源中缺少的纖維素，相關(guān)研究表明擬桿菌門能有效利用纖維素生成短鏈脂肪酸，為機體供能，從而提高對飼料中養(yǎng)分的吸收利用[33]。因此，斑點叉尾腸道中鯨桿菌屬相對豐度的增加有可能維持了其飼料系數(shù)、增重率和特定生長率不受玉米DDGS添加水平的影響。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)乳球菌屬是一種會導(dǎo)致淡水魚及海水魚干擾超急性和出血性敗血病的病原菌[34-35]，在本研究中，當(dāng)使用添加了6%玉米DDGS的飼料飼喂斑點叉尾時，其腸道中的乳球菌屬的相對豐度顯著低于其他2組，說明向飼料中添加DDGS或許能通過增加有益菌的數(shù)量來控制并減少有害菌的數(shù)量。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼料中添加12%的玉米DDGS替代部分豆粕不會對斑點叉尾的存活、生長、飼料利用、免疫力、腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響，但會使其體色和肉色變黃。