李軍輝 解玉懷 張少濤 李 敏 李世印 徐青青 張小東 張成喜 楊維仁*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，杭州 311300；3.青島潤(rùn)博特生物科技有限公司，青島 266324)

近年來，肉雞規(guī)模化養(yǎng)殖水平不斷提高，在集約化養(yǎng)殖模式下，過高的飼養(yǎng)密度及免疫功能減弱等問題，導(dǎo)致肉雞的生長(zhǎng)性能下降[1]。為了解決這些問題，抗生素被應(yīng)用于肉雞養(yǎng)殖業(yè)中，然而抗生素的大量使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥譜增多、耐藥菌株的出現(xiàn)等問題，嚴(yán)重危害肉雞的健康。于是，世界各國(guó)開始禁止抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，2019年7月，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部明確指出除中草藥外的促生長(zhǎng)藥物飼料添加劑在2020年全面退出。然而，抗生素的全面退出會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)中家禽的發(fā)病率上升、死淘率升高、腸道受損、生產(chǎn)成本增加等一系列問題，進(jìn)而導(dǎo)致養(yǎng)殖效益下降[2-3]。因此，抗生素替代物成為家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展研究的重點(diǎn)之一[4-7]。水解單寧酸是從植物中提取的多酚類化合物，可水解為沒食子酸和葡萄糖[8]，因其具有抗氧化、抗炎癥等廣泛的生物學(xué)功能而受到人們的關(guān)注。研究表明，飼糧中添加單寧酸可提高畜禽的生長(zhǎng)性能，改善腸道微生態(tài)環(huán)境[8-10]。然而，目前關(guān)于水解單寧酸直接應(yīng)用于飼料，評(píng)價(jià)其替代抗生素對(duì)肉雞影響的報(bào)道還不夠充分，對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能及腸道健康的影響還需要進(jìn)一步研究。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加水解單寧酸對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能及腸道健康的影響，為水解單寧酸在肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水解單寧酸由青島某生物科技有限公司提供，從五倍子中提取，為黃褐色顆粒，原料組成為：水解單寧酸、棕櫚油、纖維素，其中水解單寧酸含量為30.60%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取42 000只1日齡、體況相近的健康愛拔益加(AA)肉仔雞，隨機(jī)分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 500只雞。預(yù)試期10 d，正試期32 d。預(yù)試期各組統(tǒng)一飼喂基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧中不添加任何抗生素，為顆粒料。正試期對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加200和400 mg/kg水解單寧酸的試驗(yàn)飼糧?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1[11]。肉仔雞采用籠養(yǎng)，全程自由飲水和采食，按照雞場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行免疫接種。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能

每天準(zhǔn)確記錄雞只的采食量，試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)對(duì)雞只進(jìn)行空腹稱重，記錄始重、末重，計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)；每天記錄疾病和死亡情況，計(jì)算死淘率。

1.3.2 歐洲效益指數(shù)(EPI)

歐洲效益指數(shù)計(jì)算公式如下：

歐洲效益指數(shù)=[成活率×體重/(料重比×出欄天數(shù))]×10 000。

1.3.3 腸道pH

于42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取4只雞，屠宰后立即打開腹腔，分清各腸段位置進(jìn)行結(jié)扎，在各腸段前1/4處剪開一小口，用PHB-2型便攜式pH計(jì)測(cè)定十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物的pH。

1.3.4 腸道酶活性

肉雞屠宰后分別取十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物于液氮中暫時(shí)保存，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱量腸道內(nèi)容物樣品，按照腸道內(nèi)容物∶勻漿介質(zhì)=1∶9(m/V)進(jìn)行制樣，勻漿在冰水浴條件下進(jìn)行，將所得懸浮液以2 500 r/min離心10 min，取上清液用于測(cè)定十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物的胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，方法參見說明書。

1.3.5 腸道黏膜形態(tài)

肉雞屠宰后分別取十二指腸、空腸、回腸組織樣品各2～3 cm于4%甲醛固定液中固定后，流水沖洗48 h，制成石蠟切片，然后采用蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行染色。使用Nikon Eclipse 80i顯微照相系統(tǒng)觀察各腸段形態(tài)，用Motic images 2000.1.3軟件在線測(cè)量十二指腸、空腸、回腸的隱窩深度和絨毛高度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度。

1.3.6 盲腸乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量

肉雞屠宰后立即打開腹腔，取適量盲腸內(nèi)容物放于滅菌的凍存管中，采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)乳酸桿菌和大腸桿菌的數(shù)量。稱取適量?jī)?nèi)容物樣品，按照樣品∶滅菌生理鹽水=1∶9(m/V)配制成10-1倍稀釋液，再將該稀釋液進(jìn)行稀釋，配制成10-2倍稀釋液，再依次進(jìn)行10-3～10-7倍稀釋。將稀釋液接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃有氧培養(yǎng)36 h后進(jìn)行乳酸桿菌計(jì)數(shù)；將稀釋液接種于麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃有氧培養(yǎng)20 h后進(jìn)行大腸桿菌計(jì)數(shù)。每個(gè)菌種選擇3個(gè)梯度，每個(gè)稀釋梯度重復(fù)3次，盲腸內(nèi)容物微生物數(shù)量用每克腸道內(nèi)容物中含菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)[lg(CFU/g)]表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間差異分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示。

2 結(jié) 果

2.1 水解單寧酸對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加水解單寧酸對(duì)肉雞的末重、平均日增重、平均日采食量、死淘率及歐洲效益指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)；但400 mg/kg水解單寧酸組的料重比顯著降低(P<0.05)。此外，飼糧中添加200和400 mg/kg的水解單寧酸使肉雞的死淘率由4.99%分別降低至4.12%和4.07%，分別降低了17.43%和18.44%；歐洲效益指數(shù)由394.10分別提高至397.86和400.77，分別提高了0.95%和1.69%。

表2 水解單寧酸對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 水解單寧酸對(duì)肉雞腸道pH的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加水解單寧酸極顯著降低肉雞的十二指腸pH(P<0.01)；2個(gè)試驗(yàn)組的空腸和回腸pH均有所降低，但差異不顯著(P>0.05)。

表3 水解單寧酸對(duì)肉雞腸道pH的影響

2.3 水解單寧酸對(duì)肉雞腸道消化酶活性的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加水解單寧酸極顯著提高肉雞的十二指腸、空腸胰蛋白酶活性(P<0.01)；飼糧中添加400 mg/kg水解單寧酸極顯著提高十二指腸淀粉酶活性(P<0.01)，顯著提高空腸淀粉酶活性(P<0.05)；飼糧中添加200 mg/kg水解單寧酸顯著提高空腸脂肪酶活性(P<0.05)。

表4 水解單寧酸對(duì)肉雞腸道消化酶活性的影響

2.4 水解單寧酸對(duì)肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，各組肉雞的十二指腸絨毛呈現(xiàn)出寬葉片狀，絨毛密度高，而空腸和回腸絨毛多呈現(xiàn)出短柱狀，排列疏松。與對(duì)照組相比，2個(gè)試驗(yàn)組肉雞的十二指腸、空腸和回腸絨毛高度較高，腸絨毛發(fā)育較好。

A：對(duì)照組；B：200 mg/kg水解單寧酸組；C：400 mg/kg水解單寧酸組。

由表5可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加水解單寧酸極顯著提高肉雞的十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度(P<0.01)；飼糧中添加水解單寧酸極顯著提高空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度(P<0.01)；飼糧中添加400 mg/kg水解單寧酸顯著降低空腸隱窩深度(P<0.05)。

表5 水解單寧酸對(duì)肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.5 水解單寧酸對(duì)肉雞盲腸乳酸桿菌和大腸桿菌數(shù)量的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加水解單寧酸可顯著提高肉雞的盲腸乳酸桿菌數(shù)量(P<0.05)；2個(gè)試驗(yàn)組的大腸桿菌數(shù)量均有降低，但差異不顯著(P>0.05)。

表6 水解單寧酸對(duì)肉雞盲腸乳酸桿菌和大腸桿菌數(shù)量的影響

3 討 論

縮合單寧酸是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，在家禽上的研究較多。研究表明，飼糧中過多添加單寧酸可使動(dòng)物的采食量下降[12]，然而又有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加水解單寧酸可作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑提高飼糧利用率并促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)[13-14]。安文亭等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞中后期飼糧中添加1 500 mg/kg水解單寧酸可提高肉雞的采食量，降低料重比。本試驗(yàn)中，并未發(fā)現(xiàn)水解單寧酸對(duì)肉雞的采食量有影響，但可降低料重比。吳雅清[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加水解單寧酸可提高黃羽肉雞的平均成活率，其中添加水平為600 g/t時(shí)平均成活率最高，為98.33%，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，飼糧中添加水解單寧酸可降低肉雞的料重比，提高成活率及歐洲效益指數(shù)。這可能與以下2個(gè)方面有關(guān)：一方面可能是水解單寧酸通過收斂作用減弱腸道蠕動(dòng)，延長(zhǎng)飼糧在消化道內(nèi)的通過時(shí)間，從而促進(jìn)小腸的消化吸收，進(jìn)一步提高肉雞的生長(zhǎng)性能；另一方面可能是水解單寧酸的抗炎等作用在一定程度上可提高肉雞的免疫力，進(jìn)而提高成活率。

在動(dòng)物體消化系統(tǒng)中腸道pH發(fā)揮著不可替代的作用，適宜的腸道pH可促進(jìn)動(dòng)物對(duì)食物的消化和吸收[17]。然而關(guān)于水解單寧酸對(duì)畜禽腸道pH影響的報(bào)道較少。李茜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肉雞采食含有水解單寧酸的飼糧時(shí)，腸道pH降低，腸道內(nèi)環(huán)境得到改善，促進(jìn)腸道發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加水解單寧酸極顯著降低十二指腸pH。這可能與水解單寧酸本身含有三羥基苯甲酸、沒食子酸等D-葡萄糖為核心的酚醛酸聚酯類化合物有關(guān)，在堿性腸液與單寧酸水解酶的作用下可得到酸和葡萄糖，呈弱酸性，降低腸道pH，促進(jìn)水解單寧酸與消化酶結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)腸道發(fā)育。

腸道消化酶的活性與動(dòng)物體內(nèi)物質(zhì)代謝存在著密切關(guān)系。當(dāng)水解單寧酸與消化酶結(jié)合后，可以提高消化酶活性，進(jìn)而提高飼料轉(zhuǎn)化率[18]。Majumda等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼糧中添加200和300 mg/d單寧酸時(shí)，成年雞的腸道胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性顯著提高。本研究結(jié)果表明，飼糧中添加水解單寧酸可極顯著提高肉雞的十二指腸和空腸胰蛋白酶活性，400 mg/kg水解單寧酸可顯著提高空腸淀粉酶活性，200 mg/kg水解單寧酸可顯著提高空腸脂肪酶活性，這與Mole等[20]的報(bào)道結(jié)果不一致。推測(cè)可能是由于試驗(yàn)飼養(yǎng)環(huán)境不同，單寧酸的來源、純度及提取工藝有差異等因素造成的，關(guān)于水解單寧酸對(duì)腸道酶活性影響的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

腸道微生物在動(dòng)物消化吸收過程中起著至關(guān)重要的作用。水解單寧酸的抑菌能力取決于其分子質(zhì)量的大小，對(duì)不同類型的細(xì)菌存在不同的效果[28]。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，單寧酸可通過收斂、抗氧化、抗菌等作用相互協(xié)同共同改變畜禽內(nèi)部生理環(huán)境，且有很強(qiáng)的生物和藥理活性，可增強(qiáng)機(jī)體的免疫活性，維護(hù)腸道健康，對(duì)于動(dòng)物十分有益[29-32]。侯海鋒等[10]研究發(fā)現(xiàn)，水解單寧酸會(huì)改變蛋雞腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，飼糧中添加水解單寧酸可顯著降低腸道大腸桿菌定植數(shù)量，其中0.10%和0.15%添加水平可顯著增加腸道乳酸桿菌數(shù)量。魏昆鵬等[33]研究發(fā)現(xiàn)，灌服0.1 mg/mL水解單寧酸可降低家禽腸道大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量。Jamroz等[34]研究發(fā)現(xiàn)，較高劑量的單寧酸可顯著降低28日齡肉雞的腸道大腸桿菌數(shù)量。本試驗(yàn)研究表明，飼糧中添加水解單寧酸可顯著提高肉雞的盲腸乳酸桿菌數(shù)量，大腸桿菌數(shù)量呈下降趨勢(shì)。這可能是由于水解單寧酸通過引起細(xì)胞壁形態(tài)變化，增加膜通透性，進(jìn)而影響細(xì)胞代謝功能，促進(jìn)乳酸桿菌的增殖。此外，益生菌可能通過利用水解單寧酸降低腸道pH的特性，抑制有害菌的繁殖。關(guān)于水解單寧酸對(duì)腸道微生物菌群的影響，具體等待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

飼糧中添加水解單寧酸可降低肉雞的料重比和死淘率，提高歐洲效益指數(shù)、腸道消化酶活性和乳酸桿菌數(shù)量，促進(jìn)腸道發(fā)育并保護(hù)肉雞腸道健康。在本試驗(yàn)條件下，肉雞飼糧中添加400 mg/kg水解單寧酸效果最佳。