占今舜 霍俊宏 鐘小軍 雷小文 陳榮強 武艷平* 馬月輝

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.贛南科學(xué)院畜牧研究所，贛州 341401)

蘆丁(rutin)，又稱維生素P，是槲皮素C3位上的羥基和蕓香糖結(jié)合而形成的雙糖苷，它是廣泛存在于植物根、花、莖葉、果實和種子中的一種黃酮類物質(zhì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁結(jié)構(gòu)中的羥基能夠與自由基相結(jié)合，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，抑制自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[2]；能夠通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB(NF-κB)通路抑制一氧化氮(NO)和環(huán)氧化酶-2(COX-2)的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用[3]；能夠抑制大腸桿菌、綠膿桿菌等細菌的生長[4]；能夠刺激小鼠體液和細胞免疫，增強免疫作用[5]。陳密等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的蘆丁能夠提高草魚全魚粗蛋白質(zhì)含量；提高肝臟溶菌酶和超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量；提高腸道淀粉酶的活性。郭旭東[7]研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠提高奶牛的產(chǎn)奶性能，增加瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的總量和菌體蛋白的含量，提高瘤胃內(nèi)容物中纖維素酶、濾紙酶等的活性。以上結(jié)果表明，蘆丁可以作為一種飼料添加劑在動物生產(chǎn)中應(yīng)用。目前，蘆丁在羊上的研究尚未見報道。因此，本試驗開展蘆丁對湖羊生長性能、血清生化指標(biāo)和瘤胃發(fā)酵影響的研究，旨在為蘆丁在肉羊生產(chǎn)中應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用蘆丁為市購，提取自槐米，純度≥95%。

1.2 試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理

選擇3月齡左右、健康且體重相近的湖羊36只，隨機分為3組，每組12只(公母各占1/2)，公母分欄飼養(yǎng)。3組試驗羊在所喂基礎(chǔ)飼糧中分別添加0(試驗Ⅰ組)、50(試驗Ⅱ組)和100 mg/kg BW(試驗Ⅲ組)的蘆丁。參考我國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)配制基礎(chǔ)飼糧，飼糧精粗比為60∶40，精料組成及營養(yǎng)水平見表1，粗料為鍘碎的紫象草，其中紫象草干物質(zhì)中含10.98%的粗蛋白質(zhì)、2.90%的粗脂肪、14.07%的粗灰分、61.23%的中性洗滌纖維為和34.67%的酸性洗滌纖維。將蘆丁與精料拌勻后先飼喂，然后再喂鍘碎的鮮草。飼養(yǎng)試驗于2019年8—10月在江西省贛州市綠林灣農(nóng)牧有限公司湖羊養(yǎng)殖場進行，試驗期為70 d，其中預(yù)試期14 d，正試期56 d。每天飼喂2次，分別在08:30和17:30進行飼喂，自由采食，自由飲水，隔1天早上稱前1天的剩料。其他飼養(yǎng)管理按照養(yǎng)殖場的規(guī)定執(zhí)行。

表1 精料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 生長性能的測定

在試驗開始時以及正試期的第14、35和56天早上進行空腹稱重，正試期每天記錄采食量，試驗結(jié)束后計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.3.2 血清生化指標(biāo)和激素水平的測定

在正試期的第14、35和56天早上，各組選擇8只羊(公母各占1/2)，空腹頸靜脈采血5 mL，血液靜置2 h后再用離心機3 500 r/min離心10 min收集血清。血清各激素水平均采用酶聯(lián)免疫法進行測定，血清生化指標(biāo)用全自動生化分析儀通過比色法進行測定，所有指標(biāo)的檢測均由北京華英生物技術(shù)研究所完成。檢測的血清激素指標(biāo)有雌激素(E2)、生長激素(GH)、瘦素(LEP)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、胰島素(INS)和皮質(zhì)醇(COR)水平；檢測的血清生化指標(biāo)有總蛋白(TP)、尿素氮(UN)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。

1.3.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定

試驗結(jié)束當(dāng)天早上喂料前，每組選擇4只湖羊(公母各占1/2)，用瘤胃液口腔采液器采集瘤胃液。將采集的瘤胃液用4層紗布過濾后，用便攜式pH計測定瘤胃液pH，然后用離心管收集瘤胃液，保存于液氮中，之后帶回實驗室轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待測。瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸和氨態(tài)氮濃度測定參照占今舜等[8]的方法進行。

1.3.4 瘤胃細菌基因表達的測定

將冷凍的瘤胃液放在超純水中解凍，振蕩混勻后吸取300 μL瘤胃液到2 mL離心管中，然后參照試劑盒(天根生物科技有限公司)中的說明書進行細菌DNA提取。細菌引物參考Zhan等[9]中的序列進行合成，引物合成由Invitrogen公司完成。瘤胃細菌引物詳見表2。參照試劑盒(天根生物科技有限公司)中的說明書，采用熒光定量PCR法進行瘤胃細菌基因表達的檢測。以總細菌基因為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt來計算各種細菌基因的相對表達量。

表2 瘤胃細菌引物

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2016預(yù)處理，再用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，并用LDS法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加蘆丁對湖羊生長性能的影響

從表3中可知，正試期第1～14天，試驗Ⅰ組湖羊平均日增重顯著低于其他2組(P<0.05)，但料重比則顯著高于其他2組(P<0.05)，其他指標(biāo)各組間無顯著差異(P>0.05)。正試期第1～35天和第1～56天，試驗Ⅰ組湖羊平均日增重均低于其他2組，而料重比高于其他2組，但各組間差異不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧中添加蘆丁對湖羊生長性能的影響

2.2 飼糧中添加蘆丁對湖羊血清生化指標(biāo)的影響

從表4中可知，正試期第14天，試驗Ⅰ組湖羊血清葡萄糖含量顯著高于試驗Ⅱ組(P<0.05)，試驗Ⅲ組湖羊血清高密度脂蛋白含量顯著高于試驗Ⅱ組(P<0.05)，其他指標(biāo)各組間無顯著差異(P>0.05)。正試期第35天，試驗Ⅲ組湖羊血清總蛋白含量顯著低于試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組(P<0.05)，而血清甘油三酯含量則顯著或極顯著高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組(P<0.05或P<0.01)，其他指標(biāo)各組間無顯著差異(P>0.05)。正試期第56天，試驗Ⅲ組湖羊血清甘油三酯含量極顯著高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組(P<0.01)，其他指標(biāo)各組間無顯著差異(P>0.05)。

表4 飼糧中添加蘆丁對湖羊血清生化指標(biāo)的影響

2.3 飼糧中添加蘆丁對湖羊血清激素水平的影響

從表5中可知，正試期第14天，試驗Ⅱ組湖羊血清三碘甲狀腺原氨酸和瘦素水平顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)，試驗Ⅰ組湖羊血清胰島素和皮質(zhì)醇水平顯著低于試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組(P<0.05)，其他指標(biāo)各組間無顯著差異(P>0.05)。正試期第35天，試驗Ⅲ組湖羊血清甲狀腺素和胰島素水平分別顯著高于試驗Ⅱ組和試驗Ⅰ組(P<0.05)，同時三碘甲狀腺原氨酸和生長激素水平顯著高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組(P<0.05)；試驗Ⅰ組湖羊血清瘦素水平顯著低于試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組(P<0.05)，其他指標(biāo)各組間無顯著差異(P>0.05)。正試期第56天，試驗Ⅱ組湖羊血清雌二醇水平顯著高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅲ組(P<0.05)，試驗Ⅲ組湖羊血清甲狀腺素和三碘甲狀腺原氨酸水平顯著高于試驗Ⅱ組和試驗Ⅰ組(P<0.05)，試驗Ⅲ組湖羊血清生長激素水平顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)，其他指標(biāo)各組間無顯著差異(P>0.05)。

2.4 飼糧中添加蘆丁對湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

從表6中可知，試驗Ⅱ組的瘤胃液中乙酸、丙酸、異戊酸、戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著高于試驗Ⅲ組(P<0.05)，但其他指標(biāo)各組間無顯著差異(P>0.05)。

表6 飼糧中添加蘆丁對湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.5 飼糧中添加蘆丁對湖羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

從表7中可知，試驗Ⅰ組瘤胃液中棲瘤胃普雷沃菌、溶纖維丁酸弧菌和嗜淀粉瘤胃桿菌基因相對表達量顯著或極顯著高于試驗Ⅲ組和試驗Ⅱ組(P<0.05或P<0.01)，而其他2組之間無顯著差異(P>0.05)。試驗Ⅱ組瘤胃液中白色瘤胃球菌基因相對表達量顯著或極顯著高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅲ組(P<0.05或P<0.01)，其中試驗Ⅲ組最低。試驗Ⅰ組瘤胃液中黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌基因相對表達量低于試驗Ⅲ組和試驗Ⅱ組，而乳酸桿菌基因相對表達量高于試驗Ⅲ組和試驗Ⅱ組，但各組間差異不顯著(P>0.05)。

表7 飼糧中添加蘆丁對湖羊瘤胃細菌基因表達的影響

3 討 論

3.1 飼糧中添加蘆丁對湖羊生長性能的影響

黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物界的天然活性物質(zhì)，它具有改善反芻動物生產(chǎn)性能的作用。劉艷豐等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加適量的沙棘葉黃酮能夠提高阿勒泰羊的平均日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率，但對末重?zé)o顯著影響。王凱等[11]研究發(fā)現(xiàn)，紅車軸草黃酮提取物能夠顯著提高雜交肉羊的日增重，降低料重比，但對采食量和末重?zé)o顯著影響。陳仁偉[12]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥黃酮能夠提高小尾寒羊的日增重和日采食量，降低料重比。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加蘆丁能夠提高湖羊的末重、平均日增重，降低料重比，與上述研究結(jié)果相似，說明飼糧中添加適量的蘆丁有改善湖羊生長性能的作用。

3.2 飼糧中添加蘆丁對湖羊血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)能夠反映反芻動物機體器官功能和營養(yǎng)代謝狀況。血清總蛋白含量與動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)和機體生長性能相關(guān)。當(dāng)血清總蛋白含量較高時，能夠促進動物健康生長[10]。血清尿素氮含量是反映機體蛋白質(zhì)代謝和氨基酸之間平衡的一個重要指標(biāo)，氨基酸平衡良好時，血清尿素氮含量下降[13]。本試驗發(fā)現(xiàn)，整個試驗過程中，采食添加100 mg/kg BW蘆丁飼糧的湖羊血清總蛋白含量最低，而血清尿素氮含量最高，說明蘆丁添加劑量過高可能會影響湖羊體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與代謝。鄭旭煦等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠降低單純性肥胖大鼠空腹血糖水平。在本試驗中，在試驗第14和35天，試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組湖羊血清葡萄糖含量低于試驗Ⅰ組，與鄭旭煦等[14]研究結(jié)果相似，說明蘆丁有降低血糖水平的作用。胰島素能夠加速葡萄糖的利用和抑制葡萄糖的生產(chǎn)，進而降低血糖水平。在本試驗中，蘆丁能夠降低血糖水平與其升高胰島素水平有關(guān)。血清膽固醇和甘油三酯是血液中脂肪的主要成分，它們含量的高低是反映脂類吸收、代謝和利用的重要指標(biāo)。它們的含量越低，說明脂肪利用率越高[15]。高密度脂蛋白能夠轉(zhuǎn)運膽固醇，將膽固醇排出體外，而低密度脂蛋白則是把膽固醇轉(zhuǎn)運到全身[16]。在本試驗中，在整個試驗期，添加蘆丁的試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組湖羊血清總膽固醇和低密度脂蛋白的平均含量要低于未添加蘆丁的試驗Ⅰ組，而高密度脂蛋白的平均含量則高于未添加蘆丁的試驗Ⅰ組，說明蘆丁可能有助于清除機體膽固醇。然而，在正試期的第35和56天，飼糧中添加高劑量(100 mg/kg BW)蘆丁能夠極顯著增加血清甘油三酯含量，說明高劑量蘆丁會影響機體對脂肪的吸收和代謝。

3.3 飼糧中添加蘆丁對湖羊血清激素分泌的影響

蘆丁、大豆黃酮等黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素17-β-雌二醇相似，能夠與雌激素受體相結(jié)合，發(fā)揮弱雌激素樣活性。研究發(fā)現(xiàn)，適量的蘆丁能夠提高哺乳母鼠體內(nèi)雌二醇水平[17]。當(dāng)它們的添加劑量過高時，會與雌激素競爭性結(jié)合，表現(xiàn)為抗雌激素樣作用，導(dǎo)致相關(guān)內(nèi)源激素水平下降[10]。從本試驗來看，低劑量蘆丁發(fā)揮了弱雌激素樣活性，而高劑量蘆丁發(fā)揮了抗雌激素樣作用。瘦素是一種具有抑制攝食、調(diào)節(jié)脂肪沉積與能量代謝功能的蛋白質(zhì)激素[18]。研究發(fā)現(xiàn)，高效采食的牛犢體內(nèi)瘦素水平較高，剩料量較少，結(jié)果表明瘦素可能是控制采食量的主要原因[19]。從本試驗來看，飼糧中添加蘆丁能夠通過調(diào)控機體瘦素的分泌來提高湖羊的采食效率。邵美麗等[20]研究發(fā)現(xiàn)，大豆黃酮能夠提高遼寧絨山羊血液中三碘甲狀腺原氨酸和胰島素的水平。聶芙蓉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，大豆黃酮可顯著提高山羊血液中三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素、生長激素以及雌激素的水平。王凱等[11]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿和紅車軸草黃酮提取物提高了綿羊血清中生長激素和三碘甲狀腺原氨酸的水平。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，說明蘆丁能夠通過調(diào)控內(nèi)源性激素水平來促進湖羊的生長。機體內(nèi)的皮質(zhì)醇可以促進組織蛋白質(zhì)和脂肪的分解，促進糖原異生。當(dāng)機體發(fā)生應(yīng)激時，皮質(zhì)醇會相應(yīng)增多，增加動物對應(yīng)激的適應(yīng)能力[22]。本試驗也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，表明蘆丁具有提高機體抗應(yīng)激能力的作用。

3.4 飼糧中添加蘆丁對湖羊瘤胃發(fā)酵的影響

郭旭東[7]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加3.0 mg/kg BW的蘆丁能夠顯著增加奶牛瘤胃液中乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，降低瘤胃液pH和氨態(tài)氮濃度。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加低劑量(50 mg/kg BW)的蘆丁提高了湖羊瘤胃液乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸等的濃度，結(jié)果與其相似；然而，飼糧中添加高劑量(100 mg/kg BW)的蘆丁則使湖羊瘤胃液中部分揮發(fā)性脂肪的濃度下降。上述結(jié)果表明，飼糧中添加適量的蘆丁能夠改善湖羊的瘤胃發(fā)酵，但添加劑量過高則會影響瘤胃發(fā)酵。白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌等是瘤胃中主要的纖維素降解菌，而棲瘤胃普雷沃菌、溶纖維丁酸弧菌和嗜淀粉瘤胃桿菌是瘤胃中主要的蛋白質(zhì)降解菌[23]。白齊昌等[24]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加高劑量的沙棘黃酮能夠顯著降低綿羊瘤胃液中白色瘤胃球菌的數(shù)量，本試驗結(jié)果與其相似。在本試驗中，低劑量蘆丁能夠增加湖羊瘤胃液中白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌等的數(shù)量，說明低劑量蘆丁可能有助于瘤胃降解纖維素。飼糧中的纖維、淀粉等物質(zhì)被瘤胃內(nèi)微生物降解后生成揮發(fā)性脂肪酸。飼糧中添加低劑量蘆丁提高了瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸的濃度，這可能是因為低劑量蘆丁通過增加纖維降解菌的數(shù)量來促進瘤胃液對纖維的降解，生成較多揮發(fā)性脂肪酸。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加不同劑量的蘆丁均顯著或極顯著降低了湖羊瘤胃液中棲瘤胃普雷沃菌、溶纖維丁酸弧菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的數(shù)量，說明蘆丁可能會直接抑制這些細菌的生長或者通過促進這些細菌的競爭菌的生長來抑制它們生長，表明飼糧中添加蘆丁對瘤胃中蛋白質(zhì)的降解具有一定的影響。

4 結(jié) 論

蘆丁能夠通過調(diào)控湖羊體內(nèi)激素分泌來影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進而改善湖羊的生長性能。低劑量蘆丁可能通過提高纖維素降解效率來促進瘤胃發(fā)酵，而高劑量蘆丁可能通過抑制蛋白質(zhì)降解來抑制瘤胃發(fā)酵。在本試驗條件下，湖羊飼糧中添加50 mg/kg BW的蘆丁效果較好。