于 爽 王建萍 曾秋鳳 丁雪梅 白世平 張克英

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，動物抗病營養(yǎng)農業(yè)農村部重點實驗室，動物抗病營養(yǎng)四川省重點實驗室，成都 611130)

蛋白酶是催化分解蛋白質肽鍵的一類酶的總稱。飼料中外源蛋白酶的添加彌補了內源蛋白酶分泌不足的缺陷，還會提高飼料的飼用品質，提高代謝能和養(yǎng)分利用率[1]。因此，關于蛋白酶的研究引起了人們的關注。Ghazi等[2]研究發(fā)現(xiàn)，添加蛋白酶提高了豆粕的氮表觀消化率和真代謝能(TME)，彌補了家禽內源蛋白酶的不足。汪銀鋒等[3]報道，在飼糧中添加蛋白酶可彌補體內蛋白酶分泌的不足，加速對家禽蛋白質的消化吸收，提高飼糧中蛋白質的利用率，改善家禽的生長性能。Angel等[4]和Rubio等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加蛋白酶能提高肉雞的生長性能。有研究表明，飼糧中添加外源性蛋白酶不僅能提高肉雞的生長性能，還能提高養(yǎng)分利用率[6-7]。由此可見，蛋白酶在肉雞上的應用相對廣泛，同樣的，蛋白酶在肉鴨上也有相關研究。張開心等[8]研究表明，在肉鴨飼糧中添加蛋白酶，可提高肉鴨菜籽粕標準回腸氨基酸消化率。Adeola等[9]研究得出，添加蛋白酶可提高肉鴨對大豆的能量利用率并有提高干物質(DM)利用率的趨勢。目前，關于蛋白酶對肉鴨菜籽粕代謝能影響的研究較為缺乏。因此，本研究旨在采用TME結合套算法評定添加蛋白酶對5種不同蛋白質溶解度的菜籽粕肉鴨代謝能值的改善效果，為合理利用蛋白酶改善菜籽粕代謝能提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選用19周齡以上健康的櫻桃谷肉公鴨，平均體重為(3.35±0.45) kg，采取TME結合套算法進行代謝試驗。試驗設13個組，包括1個玉米組、1個豆粕組、1個饑餓內源組、5個菜籽粕不加酶組、5個菜籽粕加蛋白酶組(蛋白酶制劑添加量為200 mg/kg，蛋白酶制劑中蛋白酶活性為1×105U/g)。每個組設12個重復，每個重復1只鴨。玉米組和豆粕組也進行加酶處理，菜籽粕按40%替代玉米，豆粕按35%替代玉米。選用5種不同蛋白質溶解度的菜籽粕(分別命名為A1、A2、A3、A4、A5)，5種菜籽粕的理化特性見表1。本試驗中使用的蛋白酶制劑的蛋白酶活性定義參考李東東等[10]，蛋白酶添加量參考張開心等[8]。

表1 不同來源菜籽粕的理化特性(風干基礎)

1.2 飼養(yǎng)管理與樣品采集

代謝試驗在四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所科研試驗基地進行。所有試驗用鴨都單獨飼養(yǎng)在代謝籠中，按照常規(guī)方式進行飼養(yǎng)管理。適應期飼喂維持飼糧(參考NY/T 2122—2012《肉鴨飼養(yǎng)標準》中北京鴨的營養(yǎng)需要配制)，泄殖腔縫合集糞瓶蓋后適應1周的時間，稱量試驗鴨體重并記錄；饑餓內源組試驗鴨饑餓36 h，繼續(xù)饑餓，收集排泄物36 h；其他組試驗鴨饑餓36 h，然后按體重的2%強飼對應的待測飼糧，旋上集糞袋，記錄時間，收集排泄物36 h；排泄物間隔6 h收集1次，并置于對應的自封袋中-20 ℃保存。樣品采集結束后，將收集的排泄物置于65 ℃烘箱內烘至恒量，室溫回潮24 h后稱重并記錄，作為風干排泄物總量，然后粉碎，過40目篩，封存?zhèn)錅y。

1.3 測定指標

菜籽粕蛋白質溶解度參考豆粕蛋白質溶解度的測定方法(DB13/T 812—2006)測定。菜籽粕和排泄物中總能(GE)采用氧氮測熱法測定，DM(GB/T 6435—2006)、粗脂肪(EE)(GB/T 6433—2006)、粗蛋白質(CP)(GB/T 6432—1994)、粗纖維(CF)(GB/T 6434—2006)、中性洗滌纖維(NDF)(GB/T 20806—2006)、粗灰分(Ash)(GB/T 6438—2007)、鈣(Ca)(GB/T 6436—2002)、磷(P)含量(GB/T 6437—2002)均參照對應的國標方法測定，酸性洗滌纖維(ADF)含量參照農業(yè)行業(yè)標準《飼料中酸性洗滌纖維的測定》(NY/T 1459—2007)測定。

1.4 計算公式

養(yǎng)分真利用率計算公式：

某養(yǎng)分真利用率(%)=[(食入飼糧中某養(yǎng)分量-排泄物中該養(yǎng)分量+內源性該養(yǎng)分量)/食入飼糧中該養(yǎng)分量]×100。

代謝能計算公式：

表觀代謝能(AME)=(食入總能-排泄物中總能)/食入量；真代謝能(TME)=[食入總能-(排泄物中總能-內源總能)]/食入量；菜籽粕AME=(飼糧AME-玉米AME×飼糧中玉米的比例)/飼糧中待測菜籽粕的比例；菜籽粕TME=(飼糧TME-玉米TME×飼糧中玉米的比例)/飼糧中待測菜籽粕的比例。

氮沉積量計算公式：

RN1=(食入飼糧總氮-排泄物氮)/食入飼糧干物質重量；RN2=(食入飼糧總氮-排泄物氮+內源排泄物氮)/食入飼糧干物質重量。

式中：RN1表示家禽每攝入1 kg飼糧干物質的表觀氮沉積量；RN2表示家禽每攝入1 kg飼糧干物質去除內源氮部分的真氮沉積量。

氮校正表觀代謝能(AMEn)=AME-34.39×RN1；氮校正真代謝能(TMEn)=TME-34.39×RN2。

式中：34.39為雞每克尿氮的產熱量。

1.5 數(shù)據處理與分析

用SAS 9.0的GLM程序對試驗數(shù)據先進行單因素方差分析，再進行2×5二因素方差分析(加酶與否，5個菜籽粕來源)，主效應包括蛋白酶、菜籽粕來源以及兩者間的互作效應。試驗結果用平均值和標準誤(SE)表示，以P<0.05為差異顯著性判定標準。對菜籽粕的蛋白質溶解度與其代謝能值和飼糧養(yǎng)分利用率進行相關性分析，P<0.05為顯著相關，P<0.01為極顯著相關。

2 結 果

2.1 各組間肉鴨平均體重、強飼量、氮沉積量、氮排泄量、內源能排泄量的比較

從表2可以看出，不同組間肉鴨的平均體重、強飼量、內源能排泄量無顯著差異(P>0.05)，但表觀氮沉積量、真氮沉積量、氮排泄量存在顯著差異(P<0.05)。其中，表觀氮沉積量以A4不加蛋白酶組最高，玉米組最低；真氮沉積量以A4不加蛋白酶組和豆粕組較高，玉米組最低；氮排泄量以A1和A5不加蛋白酶組較高，玉米組最低。

表2 不同組肉鴨平均體重、強飼量、氮沉積量、氮排泄量及內源能排泄量的比較(干物質基礎)

2.2 添加蛋白酶對飼糧養(yǎng)分真利用率的影響

從表3可以看出，除菜籽粕來源對飼糧DM和Ash真利用率、蛋白酶對CF和Ca真利用率以及蛋白酶與菜籽粕來源的交互作用對Ca真利用率無顯著影響(P>0.05)外，菜籽粕來源、蛋白酶及兩者的交互作用均顯著影響飼糧的養(yǎng)分真利用率(P<0.05)。

表3 添加蛋白酶對菜籽粕飼糧養(yǎng)分真利用率的影響(風干基礎)

從菜籽粕來源對不同菜籽粕飼糧養(yǎng)分真利用率的影響來看：菜籽粕來源對飼糧養(yǎng)分真利用率的影響不同，顯著影響EE、CP、NDF、ADF、CF、Ca、P真利用率(P<0.05)，但對DM、Ash真利用率影響不顯著(P>0.05)。其中，A3、A4、A5菜籽粕飼糧的EE真利用率顯著高于A1和A2菜籽粕飼糧(P<0.05)；A3、A4菜籽粕飼糧的CP真利用率顯著高于A1菜籽粕飼糧(P<0.05)，同時A1和A2菜籽粕飼糧顯著高于A5菜籽粕飼糧(P<0.05)；A1、A4、A5菜籽粕飼糧的NDF真利用率顯著高于A2和A3菜籽粕飼糧(P<0.05)；A3菜籽粕飼糧的ADF真利用率顯著高于A5菜籽粕飼糧(P<0.05)，另外3種菜籽粕飼糧之間差異不顯著(P>0.05)；A1、A3菜籽粕飼糧的Ash真利用率顯著高于A2和A4菜籽粕飼糧(P<0.05)，同時A2和A4菜籽粕飼糧顯著高于A5菜籽粕飼糧(P<0.05)；A3菜籽粕飼糧的Ca真利用率顯著低于另外4種菜籽粕飼糧(P<0.05)；A5菜籽粕飼糧的P真利用率顯著高于A1、A3、A4菜籽粕飼糧(P<0.05)，同時A1、A3和A4菜籽粕飼糧顯著高于A2菜籽粕飼糧(P<0.05)。

從蛋白酶對不同菜籽粕飼糧養(yǎng)分真利用率影響來看：添加蛋白酶有升高飼糧CF和Ca真利用率的趨勢，對飼糧DM、EE、CP、NDF、ADF、Ash、P真利用率具有顯著的改善作用(P<0.05)。添加蛋白酶使飼糧DM、EE、CP、NDF、ADF、CF、Ash、Ca、P真利用率分別提高了3.73%、9.92%、8.51%、15.78%、17.09%、2.12%、8.55%、2.81%、12.96%，其中改善效果較好的是NDF、ADF、P真利用率。

2.3 添加蛋白酶對菜籽粕AME、TME、AMEn、TMEn的影響

從表4可以看出，菜籽粕來源、蛋白酶及兩者的交互作用均顯著影響菜籽粕的AME、TME、AMEn、TMEn(P<0.05)。

表4 添加蛋白酶對菜籽粕AME、TME、AMEn、TMEn的影響(絕干基礎)

從菜籽粕來源對菜籽粕AME、TME、AMEn、TMEn的影響來看：菜籽粕來源顯著影響菜籽粕的AME、TME、AMEn、TMEn(P<0.05)。其中，A3、A4和A5之間AME、TME、AMEn、TMEn差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于A1和A2(P<0.05)。

從添加蛋白酶對菜籽粕AME、TME、AMEn、TMEn的影響來看：添加蛋白酶對菜籽粕的AME、TME、AMEn、TMEn均有顯著的提高作用(P<0.05)，使其分別提高了2.01、2.01、1.80、1.80 MJ/kg。不同來源菜籽粕添加蛋白酶后，AME、TME、AMEn、TMEn的提高程度不同，A4和A5的TME、AMEn、TMEn提高程度不顯著(P>0.05)，A1、A2和A3的AME、TME、AMEn、TMEn提高程度顯著(P<0.05)。綜上所述，添加蛋白酶對不同來源的5種菜籽粕的代謝能值均有提高作用，但主要是對蛋白質溶解度為40%～50%的菜籽粕的代謝能值有顯著提高作用。

2.4 菜籽粕的蛋白質溶解度與養(yǎng)分真利用率和代謝能值的相關性分析

從表5可以看出，菜籽粕的蛋白質溶解度與飼糧EE真利用率呈極顯著正相關(P<0.01)，與飼糧CF、Ca、ADF真利用率呈負相關，與菜籽粕AME、TME呈顯著正相關(P<0.05)，與菜籽粕AMEn、TMEn呈極顯著正相關(P<0.01)。由此可見，菜籽粕的蛋白質溶解度與其AME、TME、AMEn、TMEn相關性很高。

表5 菜籽粕的蛋白質溶解度與養(yǎng)分真利用率、代謝能值的相關系數(shù)

3 討 論

近年來的研究表明，飼糧添加外源性蛋白酶可以改善肉雞的生長性能和養(yǎng)分利用率[6-7]。Freitas等[11]研究了在玉米、豆粕、肉骨粉中添加外源蛋白酶的效果，添加蛋白酶可提高脂肪和蛋白質的消化率和AME。Yang等[12]對淀粉酶、蛋白酶和木聚糖酶組成的復合酶在肉雞飼糧中的耐熱性和有效性進行了研究，得出添加復合酶對36日齡肉雞飼喂玉米粉和豆粕飼糧的養(yǎng)分消化率有明顯的改善作用。Ghazi等[2]在肉雞上的應用研究表明，蛋白酶P2處理提高了氮表觀消化率和TME。郭正富等[13]研究表明，飼糧添加蛋白酶顯著提高了肉雞的AME、總能和氮的利用率。本研究結果表明，蛋白酶對菜籽粕的AME、TME、AMEn、TMEn有提高作用，且對飼糧不同養(yǎng)分的真利用率有不同程度提高，與上述學者研究結果一致。

蛋白酶主要是通過補充內源消化酶的不足來提高養(yǎng)分的利用率[14]。奚剛等[15]的研究表明，加酶組絲毛烏骨雞37和67日齡胃蛋白酶活性分別比對照組增加了5.39%和5.37%，小腸中胰蛋白酶和總蛋白酶活性與對照組相比也有所提高。此外，外源蛋白酶有助于中和飼料中抗營養(yǎng)因子的的負面影響，并將大的蛋白質分子分解成較小的可吸收的片段[16]。Douglas等[17]和Ghazi等[18]的研究表明，蛋白酶可以最小化與大豆蛋白相關的抗營養(yǎng)作用。唐德富等[19]的研究顯示，添加含木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶的外源復合酶制劑A和B均可提高3種菜籽粕的AME和AMEn，推測其原因是添加外源性復合酶制劑使部分抗營養(yǎng)因子得到降解，抗營養(yǎng)作用得到解除，進而促進了養(yǎng)分的消化利用。此外，蛋白酶還可改善家禽的生長性能，提高家禽對飼糧的消化效率，提高機體免疫力，且減少氮排放量[20]。

蛋白質溶解度低于35%時，表示加熱過度，蛋白質遭到了破壞，而蛋白質溶解度在35%～88%時，蛋白質品質無太大差別[21]。Pastuszewska等[22]的研究顯示，蛋白質溶解度在55%～60%的菜籽粕具有較高的營養(yǎng)價值。目前，關于菜籽粕蛋白質溶解度與其代謝能值關系的研究相對較少，更多的是關于加熱過程對菜籽粕蛋白質溶解度影響的研究。唐精等[23]的研究表明，加熱會使游離氨基酸與其他化合物的基團形成牢固的不能被消化酶所打開的分子間和分子內的結合鍵，從而降低蛋白質溶解度。初雷等[24]在研究菜籽粕的品質指標變化規(guī)律及相互關系時也指出菜籽粕加熱時，還原糖會與某些氨基酸的N-末端或賴氨酸的ε-側鏈結合，使較多的氨基酸轉變?yōu)槔w維的一部分，因而降低菜籽粕的蛋白質溶解度，升高纖維水平。纖維作為菜籽粕的抗營養(yǎng)因子，其水平的升高勢必會造成代謝能值的降低。本試驗結果也同樣發(fā)現(xiàn)，菜籽粕的蛋白質溶解度與菜籽粕飼糧的CF、NDF、ADF真利用率呈負相關，印證了這一觀點。

4 結 論

① 添加蛋白酶顯著提高菜籽粕飼糧的DM、EE、CP、NDF、ADF、Ash、P真利用率。

② 添加蛋白酶顯著提高菜籽粕的AME、TME、AMEn、TMEn，蛋白酶對蛋白質溶解度為40%～50%的菜籽粕代謝能值的改善程度較大。

③ 菜籽粕的蛋白質溶解度與其AME、TME呈顯著正相關，與其AMEn、TMEn呈極顯著正相關。