程 浩 唐圣果* 賀長青 郭松長 陳繼發(fā) 曲湘勇*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，宜春 336000)

近年來，抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖中濫用，致使細(xì)菌耐藥性、食品安全和藥物殘留問題日益突出。自2020年7月1日起，我國全面禁止在動(dòng)物飼料中添加促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)。飼料禁抗后對(duì)動(dòng)物腸道健康和生產(chǎn)性能會(huì)帶來一定負(fù)面影響[1]。因此，尋找安全、有效的飼用抗生素替代品已成為畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要課題。當(dāng)動(dòng)物腸道被大量病原菌侵襲時(shí)，過度繁殖的病原菌會(huì)造成腸道菌群失衡，破壞腸黏膜屏障功能，降低機(jī)體免疫能力，進(jìn)而降低動(dòng)物生產(chǎn)性能，甚至增加死亡率[2]。百里香酚和香芹酚是芳香植物精油的主要成分，對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒均有一定抑制作用，在食品、化妝品和動(dòng)物養(yǎng)殖等方面有著較廣泛的應(yīng)用[3-4]。但由于植物精油難溶于水、揮發(fā)性強(qiáng)、分子結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境敏感、耐熱性差等原因，需要改善植物精油的穩(wěn)定性以提高其應(yīng)用效果[5]。凹凸棒石是一種鏈層狀結(jié)構(gòu)黏土，因其吸附能力強(qiáng)、比表面積大、具有催化性等特性，常被作為載體應(yīng)用于工業(yè)和動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域[6-7]。楊勇等[8]報(bào)道，將銀(Ag)、溴化銀(AgBr)和二氧化鈦(TiO2)等無機(jī)物負(fù)載于凹凸棒石，結(jié)合后產(chǎn)物的抑菌效果較凹凸棒石顯著增強(qiáng)。Lei等[9]研究指出，改性凹凸棒石與姜精油復(fù)合物比單純的姜精油表現(xiàn)出更好的抗菌性能，且有靶向抑菌能力；此外，該復(fù)合物具有很好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性。本研究以凹凸棒石為載體，負(fù)載植物精油，將多種活性成分通過工藝制備，組裝成凹凸棒石負(fù)載植物精油復(fù)合物(essential oil/palygorskite composite，EO-PGS)，推測(cè)其能夠有效抑制腸道有害菌，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善腸道健康，進(jìn)而提高蛋雞生產(chǎn)性能。因此，本試驗(yàn)旨在探討飼糧添加不同水平EO-PGS對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能和腸道微生物的影響，以期為其在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用EO-PGS由江蘇某生物科技股份有限公司提供，其主要成分含量為：凹凸棒石>70%，植物精油(百里香酚精油和香芹酚精油等)>15%，其他礦物元素<15%。利用凹凸棒石的納米特性，通過凹凸棒石表面改性、電荷調(diào)控、抗菌因子組裝、表面交聯(lián)等工藝制備EO-PGS。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選取480只65周齡、體重相近、健康的羅曼粉殼蛋雞，隨機(jī)分成4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞。預(yù)試期各組統(tǒng)一飼喂基礎(chǔ)飼糧。正試期對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.50、0.75和1.00 g/kg EO-PGS的試驗(yàn)飼糧?；A(chǔ)飼糧參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

試驗(yàn)雞采用雙層階梯式籠養(yǎng)，飼養(yǎng)于上、下2層，每籠4只，每5籠為1個(gè)重復(fù)；飼養(yǎng)管理按照雞場常規(guī)管理程序進(jìn)行。試驗(yàn)雞自由采食和飲水，預(yù)試期7 d，正試期56 d。

1.3 生產(chǎn)性能的測(cè)定

正試期內(nèi)，每日以重復(fù)為單位記錄各組產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、軟破殼蛋數(shù)及死淘雞數(shù)，每周統(tǒng)計(jì)1次采食量，計(jì)算統(tǒng)計(jì)期內(nèi)的產(chǎn)蛋率、平均蛋重、死淘率、料蛋比、日產(chǎn)蛋重和平均日采食量。

1.4 腸道內(nèi)容物樣品采集

試驗(yàn)第56天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只接近平均體重的雞，放血死亡后，剖開腹腔，取十二指腸和盲腸內(nèi)容物樣品置于2 mL凍存管中，于-80 ℃保存。

1.5 腸道內(nèi)容物微生物相對(duì)豐度的測(cè)定

選取十二指腸和盲腸內(nèi)容物樣品180～220 mg，采用糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328，天根生化科技有限公司)提取腸道內(nèi)容物DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop ND-2000 UV，Thermo Fisher Scientific公司，美國)檢測(cè)DNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度。

每個(gè)DNA樣品的濃度檢測(cè)3次，計(jì)算平均值，將24個(gè)DNA樣品的濃度統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL。使用熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]并參照其說明書進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL：SYBR 5.0 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DNA 1.0 μL，雙蒸水3.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 40 s，39個(gè)循環(huán)；在65～95 ℃繪制熔解曲線。引物采用Primers軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表2，所有引物經(jīng)特異性檢測(cè)合格后再使用。以總菌為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的細(xì)菌的相對(duì)豐度[10]。

表2 引物序列

1.6 盲腸菌群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)分析

數(shù)據(jù)優(yōu)化：使用Trimmomatic軟件原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用Flash v1.2.11軟件進(jìn)行拼接：對(duì)經(jīng)過雙端(pair-end)測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，截?cái)嗷蛏釛壍唾|(zhì)量序列(50個(gè)連續(xù)堿基平均質(zhì)量>Q30，接頭污染、含有N堿基的reads)。利用軟件Uparse 7.0.1090，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，使用UCHIME軟件剔除嵌合體。選取每個(gè)類最長的序列為代表序列，通過RDP-Classifier v2.11軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫有比對(duì)進(jìn)行物種注釋，得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息。通過軟件Mothur 1.30.2和Qiime 1.9.1對(duì)生成的OTU信息進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

微生物測(cè)序數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，生產(chǎn)性能和微生物相對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著者采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有提高或降低的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EO-PGS對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，試驗(yàn)組蛋雞的產(chǎn)蛋率較對(duì)照組均有所提高，其中0.75和1.00 g/kg EO-PGS組的產(chǎn)蛋率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各組間平均日采食量、平均蛋重、日產(chǎn)蛋重、料蛋比和死淘率均差異不顯著(P>0.05)。

表3 EO-PGS對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 EO-PGS對(duì)蛋雞盲腸菌群α多樣性的影響

由表4可知，各組樣品測(cè)序覆蓋率均在99.5%以上，說明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中的所有物種。各組樣品測(cè)序獲得的有效序列和盲腸菌群Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

表4 EO-PGS對(duì)蛋雞盲腸菌群α多樣性的影響

2.3 EO-PGS對(duì)蛋雞盲腸菌群β多樣性的影響

β多樣性分析可以比較不同樣品間在物種多樣性方面存在的差異大小。如圖1所示，經(jīng)主坐標(biāo)分析(PCoA)，結(jié)果顯示對(duì)照組和0.50 g/kg EO-PGS組菌群結(jié)構(gòu)分布相對(duì)緊湊，相似度較高，而0.75和1.00 g/kg EO-PGS組菌群結(jié)構(gòu)分布相對(duì)零散，相似度低，群落構(gòu)成差異較大。

A：對(duì)照組 control group；B：0.50 g/kg EO-PGS組 0.50 g/kg EO-PGS group；C：0.75 g/kg EO-PGS組 0.75 g/kg EO-PGS group；D：1.00 g/kg EO-PGS組 1.00 g/kg EO-PGS group。

2.4 EO-PGS對(duì)蛋雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)和物種豐度的影響

由表5可知，在門水平上，各組中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門均為優(yōu)勢(shì)菌門，其中擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度分別為45.43%～53.27%和38.39%～46.14%。對(duì)照組盲腸中相對(duì)豐度排第4的菌門為螺旋體門，而0.50、0.75和1.00 g/kg EO-PGS組為放線菌門。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，各組間優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度均無顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組軟壁菌門相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì)(P=0.071)，0.50和0.75 g/kg EO-PGS組迷蹤菌門相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)。

表5 相對(duì)豐度大于0.15%(序列占測(cè)序總量比例)的菌門

由表6可知，在相對(duì)豐度大于0.7%的菌屬中，各組中擬桿菌屬和考拉桿菌屬均為優(yōu)勢(shì)菌屬。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：各組間優(yōu)勢(shì)菌屬?zèng)]有顯著差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，0.50和0.75 g/kg EO-PGS組Elusimicrobium相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，0.50 g/kg EO-PGS組優(yōu)桿菌屬相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)。此外，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬相對(duì)豐度均有不同程度的提高(P>0.05)，志賀氏菌屬相對(duì)豐度有不同程度的降低(P>0.05)。

表6 相對(duì)豐度大于0.7%(序列占測(cè)序總量比例)或差異顯著的菌屬

2.5 EO-PGS對(duì)蛋雞腸道內(nèi)容物微生物相對(duì)豐度的影響

由表7可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組十二指腸雙歧桿菌相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì)(P=0.065)，0.50 g/kg EO-PGS組乳酸桿菌相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組盲腸雙歧桿菌相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，沙門氏菌相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，0.50 g/kg EO-PGS組乳酸桿菌相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，0.50和1.00 g/kg EO-PGS組大腸桿菌相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

表7 EO-PGS對(duì)蛋雞腸道微生物相對(duì)豐度的影響

3 討 論

3.1 EO-PGS對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

研究表明，植物精油具有抑菌、抗炎、增強(qiáng)免疫等多種生物學(xué)功能，飼糧添加植物精油對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能有積極作用[11-12]。Wang等[13]研究表明，飼糧添加植物精油混合物可以提高蛋雞產(chǎn)蛋率，一定程度上降低料蛋比。Akbari等[14]研究發(fā)現(xiàn)，薄菏精油和百里香精油能有效緩解蛋雞因寒冷引起的生產(chǎn)性能下降，提高產(chǎn)蛋率。此外，Qiao等[15]研究表明，飼糧添加天然凹凸棒石和熱改性凹凸棒石均可改善蛋雞的消化功能，一定程度上提高產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.50、0.75和1.00 g/kg EO-PGS提高了蛋雞產(chǎn)蛋率，一定程度上降低了死淘率和料蛋比。目前，已有較多學(xué)者開展了植物精油和凹凸棒石單獨(dú)應(yīng)用于蛋雞生產(chǎn)中的研究，盡管試驗(yàn)結(jié)果存在差異，但總體上表明它們能在不同程度上提高蛋雞的生產(chǎn)性能[13-15]，本試驗(yàn)結(jié)果與前人的報(bào)道基本相符。

3.2 EO-PGS對(duì)蛋雞盲腸菌群多樣性的影響

研究表明，宿主與腸道微生物之間互利共生，宿主自身的生長狀況影響腸道微生物的生長定植，同時(shí)腸道微生物可以參與宿主營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，微生物多樣性的增加有利于提高機(jī)體免疫功能[16]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組蛋雞盲腸菌群有效序列和對(duì)照組之間無顯著差異，但試驗(yàn)組樣品中反映α多樣性的Shannon指數(shù)均高于對(duì)照組，Simpson指數(shù)均低于對(duì)照組，說明試驗(yàn)組樣品中微生物菌群更豐富；根據(jù)PCoA中β多樣性發(fā)現(xiàn)，0.75和1.00 g/kg EO-PGS組菌群結(jié)構(gòu)分布相對(duì)零散，相似度低，群落構(gòu)成差異較大，說明微生物的多樣性有一定提高。張超[17]基于16S rDNA高通量測(cè)序分析腸炎小鼠腸道微生物多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，炎癥性腸病小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)紊亂，腸道菌群多樣性降低；經(jīng)植物精油治療后，腸炎小鼠腸道微生物多樣性提高。辛洪亮[18]采用PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)及DNA測(cè)序技術(shù)研究植物精油混合物對(duì)肉雞腸道微生物多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)前期、后期和全期添加精油對(duì)腸道微生物多樣性均無顯著影響，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3.3 EO-PGS對(duì)蛋雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)和物種相對(duì)豐度的影響

家禽腸道微生物數(shù)量多，組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，前人研究發(fā)現(xiàn)，家禽的腸道菌群主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋雞盲腸菌群以擬桿菌門和厚壁菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，二者相對(duì)豐度在90%以上，且添加EO-PGS后2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度沒有顯著變化，可能與健康的成年蛋雞腸道中已經(jīng)形成較穩(wěn)定的微生物區(qū)系有關(guān)，雖然EO-PGS可能在腸道內(nèi)抑制部分有害菌如大腸桿菌、沙門氏菌的增殖，但很難引起腸道主要微生物發(fā)生很大變化。研究指出，糖代謝異常和非酒精性脂肪肝小鼠腸道中軟壁菌門的相對(duì)豐度降低，機(jī)體血脂異常和炎癥程度都有所加劇[20-21]。麥云珮等[22]報(bào)道，香芹酚可有效降低1型糖尿病小鼠血液中葡萄糖含量，改善機(jī)體糖脂代謝。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組軟壁菌門相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì)且呈劑量效應(yīng)，且香芹酚是EO-PGS的主要組成成分，提示EO-PGS可能具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善糖代謝的作用。黃飛[23]研究了高脂飼糧誘導(dǎo)的SD大鼠模型腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)模型組血液大鼠高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)含量顯著降低，血液低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)含量顯著升高，糖代謝出現(xiàn)異常，腸道菌群樣本相對(duì)豐度和多樣性顯著降低，厚壁菌門和迷蹤菌門相對(duì)豐度顯著降低，腸屏障修復(fù)能力下降；經(jīng)復(fù)方中藥治療后，腸道菌群多樣性顯著提高，腸道屏障修復(fù)能力得到恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，0.50和0.75 g/kg EO-PGS組迷蹤菌門的相對(duì)豐度顯著提高，進(jìn)一步說明EO-PGS可能具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和改善糖代謝的作用。

在屬水平上，飼糧添加EO-PGS對(duì)盲腸優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度沒有顯著差異。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組Elusimicrobium相對(duì)豐度顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，Elusimicrobium可產(chǎn)生醋酸鹽和丙氨酸，這可能對(duì)肝損傷和葡萄糖-丙氨酸循環(huán)有益[24]。Shi等[25]報(bào)道，飼糧添加乳桿菌和片球菌后，肝硬化小鼠癥狀得到改善，肝臟和腸道中炎癥因子含量減少，Eluximicrobium和普雷沃菌屬等潛在有益菌的相對(duì)豐度提高，且與白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-17含量呈高度負(fù)相關(guān)。本研究表明，0.75和1.00 g/kg EO-PGS組盲腸菌群中乳桿菌屬和普雷沃菌相對(duì)豐度均高于對(duì)照組。這提示EO-PGS可能與有益菌一樣，具有降低機(jī)體炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。此外，試驗(yàn)組腸道中優(yōu)桿菌屬相對(duì)豐度較對(duì)照組均有不同程度提高，其中0.50 g/kg EO-PGS組優(yōu)桿菌屬相對(duì)豐度顯著提高。研究表明，優(yōu)桿菌屬包含眾多產(chǎn)丁酸鹽菌群，是一種有益于宿主健康的菌屬[26-27]。朱林文思[28]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者中腸道優(yōu)桿菌屬相對(duì)豐度較低的患者，術(shù)后再發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較大。這提示EO-PGS可能具有增強(qiáng)腸道免疫的作用。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)添加EO-PGS后，試驗(yàn)組其他菌屬的物種相對(duì)豐度有所改變，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異，不能作為評(píng)判EO-PGS是否影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和物種相對(duì)豐度的標(biāo)志。

3.4 EO-PGS對(duì)蛋雞腸道內(nèi)容物微生物相對(duì)豐度的影響

腸道病原菌的過度繁殖容易引起腸道屏障受損和腸道炎癥，影響腸道健康[29-30]。研究表明，植物精油能夠通過破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，影響蛋白質(zhì)和DNA合成等多種途徑來發(fā)揮抑菌作用[31-32]。Tiihonen等[33]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加15 g/t的百里香酚和5 g/t肉桂醛植物精油，肉雞盲腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)量顯著降低，乳酸桿菌數(shù)量顯著增加。韓旭[34]研究發(fā)現(xiàn)，牛至油能夠顯著提高蛋雞雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，同時(shí)降低大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，一定程度上改善腸道功能，促進(jìn)腸道健康。此外，有研究指出，凹凸棒石內(nèi)部存在強(qiáng)大的庫侖場和極性，具有很強(qiáng)的吸附性，能夠吸附大腸桿菌和假單胞菌等致病菌[35]。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組蛋雞盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌和大腸桿菌相對(duì)豐度均低于對(duì)照組；0.50 g/kg EO-PGS組盲腸和十二指腸乳酸桿菌相對(duì)豐度顯著提高，試驗(yàn)組盲腸和十二指腸雙歧桿菌相對(duì)豐度均有所提高，這與前人研究結(jié)果基本一致，提示飼糧中添加EO-PGS能夠優(yōu)化蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善腸道健康。

研究表明，腸道有害菌數(shù)量的減少和有益菌數(shù)量的增多對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能有積極作用，可能是因?yàn)橄魅趿擞泻c宿主之間對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的競爭、減少了因致病菌過度繁殖引起的腸道疾病以及促進(jìn)有益菌代謝物的產(chǎn)生改善腸道屏障功能[36-37]。綜上所述，有害菌(大腸桿菌和沙門氏菌)數(shù)量的降低和有益菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)數(shù)量的增加以及腸道微生物多樣性的一定程度的提高可能是本試驗(yàn)中蛋雞產(chǎn)蛋性能改善的一個(gè)重要原因。

4 結(jié) 論

飼糧添加0.75和1.00 g/kg EO-PGS可以顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率；飼糧添加EO-PGS能夠在一定程度上提高蛋雞腸道微生物多樣性，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。