趙廣民 劉秀婷 代 兵 楊 華 呂文濤 王遠霞 肖英平*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 311300；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，杭州 310021；3.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，杭州 310021)

產(chǎn)丁酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物、主要代謝產(chǎn)物為丁酸的細菌統(tǒng)稱[1]。常見產(chǎn)丁酸菌主要包括：丁酸弧菌屬(Anaerostipes)、布勞特氏菌屬(Blautia)、丁酸球菌屬(Butyricicoccus)、丁酸單胞菌屬(Butyricimonas)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)、羅斯伯里氏菌屬(Roseburia)、真桿菌屬([Eubacterium]halliigroup)等[1-4]，其主要通過丁酸激酶途徑和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶途徑生成丁酸。腸道產(chǎn)丁酸菌作為益生菌對人和動物的生理機能均具有重要意義，其分解未被消化的膳食纖維產(chǎn)生丁酸是結(jié)腸細胞能量的主要來源，并對腸黏膜修復(fù)及結(jié)腸炎和結(jié)腸癌的預(yù)防起重要作用[2]，有些產(chǎn)丁酸菌可通過本身的結(jié)構(gòu)和免疫特性發(fā)揮抗炎癥作用[5]，其數(shù)量和多樣性的變化還能預(yù)測機體的健康狀況[6]。在經(jīng)濟動物方面，丁酸能夠提高動物的免疫功能、促進動物生長，并且可通過調(diào)節(jié)脂肪沉積從而影響肉品質(zhì)，因此，腸道產(chǎn)丁酸菌與其代謝產(chǎn)物丁酸是調(diào)控動物經(jīng)濟性狀的重要研究靶點[7]。

金華豬是我國優(yōu)良地方豬種，具有肉質(zhì)好、繁殖率高、脂肪沉積能力強等優(yōu)良特性；長白豬原產(chǎn)于丹麥，具有生長速度快、飼料利用率高、瘦肉率高等特點，這2個品種豬是研究肉品質(zhì)與腸道微生物之間關(guān)系的重要模型[8-9]。通過采集糞便分析發(fā)現(xiàn)，金華豬腸道優(yōu)勢菌屬主要包括：乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬、SMB53、雙歧桿菌屬、顫螺旋菌屬、糞球菌屬等[10]，而長白豬腸道優(yōu)勢菌屬主要包括：梭菌屬、SMB53、鏈球菌屬、普氏菌屬、乳酸桿菌屬、Turicibacter、瘤胃球菌屬等[11]。本課題組前期將金華豬和長白豬飼養(yǎng)于相同環(huán)境中，并飼喂相同飼糧，對其腸道菌群結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，金華豬和長白豬腸道中菌群結(jié)構(gòu)存在較大的差異，特別是在小腸段中[12]。將金華豬和長白豬腸道微生物移植于抗生素處理小鼠，小鼠可以在一定程度上重現(xiàn)豬的體脂體征，且小鼠腸道內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量變化也與供體豬相一致，說明了豬腸道微生物可通過產(chǎn)短鏈脂肪酸干預(yù)豬的體脂代謝[9]。丁酸作為具有多種生物學(xué)功能的短鏈脂肪酸之一，其調(diào)節(jié)脂肪代謝功能在人[13-14]、小鼠[15]和雞[7]試驗中均已得到證實，但在與豬體脂代謝方面的研究較少，特別是對于豬不同品種和不同腸段中產(chǎn)丁酸菌、產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因相對表達量和丁酸含量相關(guān)性研究。因此，本研究旨在將肥胖型金華豬和瘦肉型長白豬作為研究對象，分析不同脂肪沉積能力豬各腸段主要產(chǎn)丁酸菌、丁酸關(guān)鍵功能基因相對表達量以及丁酸含量的差異，揭示豬腸道丁酸代謝與體脂沉積的相關(guān)性，為豬腸道微生物丁酸代謝研究和脂肪沉積調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

分別選擇金華豬和長白豬仔豬各18頭，公母各占1/2，飼養(yǎng)于相同環(huán)境中，飼喂相同的飼糧，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，自由飲水和采食。在240日齡階段，從每個品種中選擇體重相近的公、母豬各5頭屠宰取樣，其中金華豬體重(70.6±9.4) kg，背膘厚(2.71±0.45) cm，長白豬體重(124.5±5.1) kg，背膘厚(1.72±0.16) cm[12]，分別收集十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物于液氮中速凍后-80 ℃保存。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 DNA提取和功能基因相對表達量的實時熒光定量PCR分析

采用QIAamp DNA Stool Mini試劑盒(QIAGEN)提取各腸段內(nèi)容物微生物基因組DNA。參照Xu等[16]的引物序列對金華豬和長白豬各腸段丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(上游引物5′-AAGGATCTCGGIRTICAYWSIGARATG-3′；下游引物5′-GAGGTCGTCICKRAAITYIGGRTGNGC-3′)和丁酸激酶(上游引物5′-TGCTGTWGTTGGWAGAGGYGGA-3′；下游引物5′-GCAACIGCYTTTTGATTTAATGCATGG-3′)基因相對表達量進行實時熒光定量PCR分析。實時熒光定量PCR在ABI 7500型定量PCR儀中進行。體系為10 μL，其中包含了5.0 μL SYBRTMGreen qPCR mix，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 4.0 μL。程序為：95 ℃，2 min預(yù)變性；95 ℃，15 s；58 ℃，45 s；72 ℃，1 min；共35個循環(huán)。每個樣品做3個重復(fù)，最終依據(jù)測得的Ct值與標準曲線比較計算樣品中DNA拷貝數(shù)(基因相對表達量)。

1.3 高通量測序和生物信息分析

對細菌16S-rRNA基因的V4高變區(qū)進行擴增，引物序列如下：515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，在Illumina HiSeq 2500上測序。通過QIIME平臺在97%相似性水平上對操作分類單元(OTUs)進行分類。使用Sliva數(shù)據(jù)庫對所有OTUs的代表性序列進行物種匹配，根據(jù)最終的有效數(shù)據(jù)(effective Tags)統(tǒng)計各個樣本中各分類水平相對豐度。

1.4 丁酸含量測定

參照Xiao等[11]的方法，準備1.5 mL離心管，將0.1 g左右各腸段內(nèi)容物樣品，置于管中并加入9倍體積(mL)的超純水，充分振蕩混勻后，12 000 r/min離心10 min，離心后取上清液0.5 mL置于1.5 mL離心管中，隨后加入0.1 mL的25%(w/v)偏磷酸與巴豆酸(內(nèi)標)混合溶液，在-20 ℃環(huán)境下保存過夜。上樣前使用0.22 μm濾膜進行過濾，采用12 000 r/min離心10 min的方式對濾液進行處理，離心處理后取500 μL上清液于氣相色譜儀上進行測定，色譜柱采用毛細管色譜柱(InertCap FFAP)。色譜條件設(shè)置為：柱溫110 ℃，汽化室溫度180 ℃；采用FID檢測器，檢測溫度180 ℃；載氣為氮氣，壓力為0.06 MPa，氧氣壓力0.05 MPa，氫氣壓力0.05 MPa，靈敏度為10-1，衰減3.0。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0中的非配對t檢驗進行差異顯著性分析，采用Graphpad 8軟件作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差(means±SD)表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。采用R軟件進行斯皮爾曼相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 金華豬和長白豬不同腸段主要產(chǎn)丁酸菌的相對豐度比較

選取9種重要的常見產(chǎn)丁酸菌屬進行分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，金華豬和長白豬腸道產(chǎn)丁酸菌差異主要體現(xiàn)在小腸段，金華豬空腸、回腸中布勞特氏菌屬、丁酸球菌屬、丁酸單胞菌屬、糞桿菌屬、真桿菌屬相對豐度顯著低于長白豬(P<0.05)；而顫螺旋菌屬和羅斯伯里氏菌屬顯著高于長白豬(P<0.05)。

Anaerostipes：丁酸弧菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；Butyricimonas：丁酸單胞菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Fusobacterium：梭桿菌屬；Oscillospira：顫螺旋菌屬；Roseburia：羅斯伯里氏菌屬；[Eubacterium] hallii group：真桿菌屬?！?”：P<0.05。下圖同 The same as below。

分別對金華豬和長白豬的9種常見產(chǎn)丁酸菌相對豐度進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，在金華豬中，丁酸弧菌屬、顫螺旋菌屬、糞桿菌屬、布勞特氏菌屬、丁酸球菌屬、羅斯伯里氏菌屬和真桿菌屬相對豐度間呈極顯著正相關(guān)(r=0.20～0.84，P<0.01)；在長白豬中，布勞特氏菌屬、丁酸球菌屬、丁酸單胞菌屬、糞桿菌屬和真桿菌屬相對豐度間呈極顯著正相關(guān)(r=0.41～0.88，P<0.01)。

圖2 金華豬和長白豬腸道9種主要產(chǎn)丁酸菌屬相對豐度的相關(guān)性分析

2.2 金華豬和長白豬各腸段產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因相對表達量比較

通過實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因主要在大腸段富集。金華豬回腸段丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量顯著低于長白豬(P<0.05)，且金華豬結(jié)腸段丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量顯著低于長白豬(P<0.05)。

圖3 丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量比較

2.3 金華豬和長白豬各腸段丁酸含量比較

通過對金華豬和長白豬各腸段內(nèi)容物中丁酸含量進行分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，盲腸和結(jié)腸是丁酸的主要產(chǎn)生部位，在空腸、回腸、結(jié)腸中，金華豬丁酸含量均顯著低于長白豬(P<0.05)。

圖4 不同腸段丁酸含量比較

2.4 金華豬和長白豬腸道主要產(chǎn)丁酸菌相對豐度與丁酸含量和產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因相對表達量的相關(guān)性分析

通過對金華豬和長白豬各腸段主要產(chǎn)丁酸菌相對豐度與丁酸含量和產(chǎn)丁酸關(guān)鍵基因相對表達量進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表2)，金華豬和長白豬腸道丁酸含量均與丁酸弧菌屬、布勞特氏菌屬、顫螺旋菌屬、羅斯伯里氏菌屬相對豐度呈顯著或極顯著正相關(guān)(r=0.318 0～0.700 6，P<0.05或P<0.01)；金華豬和長白豬腸道丁酸激酶基因相對表達量均與丁酸弧菌屬、顫螺旋菌屬、羅斯伯里氏菌屬相對豐度呈顯著或極顯著正相關(guān)(r=0.318 4～0.659 9，P<0.05或P<0.01)；金華豬和長白豬腸道丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量均與顫螺旋菌屬、羅斯伯里氏菌屬相對豐度呈極顯著正相關(guān)(r=0.581 3～0.649 0，P<0.01)。

表2 腸道產(chǎn)丁酸菌相對豐度與丁酸含量和產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因相對表達量的相關(guān)性分分析

2.5 金華豬和長白豬腸道微生物產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因相對表達量與丁酸含量的相關(guān)性分析

通過對腸道丁酸含量與丁酸激酶、丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，丁酸激酶、丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量與丁酸含量呈極顯著正相關(guān)(r=0.570 4～0.722 1，P<0.01)，2個品種對比發(fā)現(xiàn)長白豬相關(guān)系數(shù)均高于金華豬。

圖5 丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量與丁酸含量相關(guān)性分析

3 討 論

腸道中丁酸是由產(chǎn)丁酸菌在對膳食纖維和未分解的食用碳水化合物、內(nèi)源蛋白質(zhì)進行發(fā)酵的過程中代謝產(chǎn)生的[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，金華豬和長白豬腸道產(chǎn)丁酸菌差異主要在小腸段，長白豬空腸、回腸內(nèi)容物中布勞特氏菌屬、丁酸球菌屬、丁酸單胞菌屬、糞桿菌屬、真桿菌屬相對豐度顯著高于金華豬，長白豬空腸、回腸內(nèi)容物中顫螺旋菌屬和羅斯伯里氏菌屬相對豐度顯著低于金華豬。通過斯皮爾曼相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，顫螺旋菌屬、羅斯伯里氏菌屬相對豐度與其他幾種主要產(chǎn)丁酸菌相對豐度呈顯著負相關(guān)。

產(chǎn)丁酸菌生成丁酸主要有2條途徑，即丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶和丁酸激酶代謝途徑[18]。已有研究表明，單胃動物腸道微生物的產(chǎn)丁酸主要途徑是丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶途徑，而土壤微生物的主要產(chǎn)丁酸途徑是丁酸激酶途徑[19]。Louis等[20]研究結(jié)果認為可以通過丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因和丁酸激酶基因的基因拷貝數(shù)來計算產(chǎn)丁酸菌的拷貝數(shù)。因此，本試驗通過實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，金華豬結(jié)腸段丁酸激酶、丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量和丁酸含量均顯著低于長白豬。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)丁酸菌相對豐度和丁酸含量及產(chǎn)丁酸關(guān)鍵基因相對表達量均呈不同程度的正相關(guān)關(guān)系，丁酸含量和丁酸激酶、丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量呈顯著正相關(guān)，且長白豬相關(guān)系數(shù)均高于金華豬。

丁酸作為腸道微生物重要的代謝產(chǎn)物能夠影響宿主基因的表達和參與機體代謝[21]。首先，丁酸可以促進腸道細胞血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)的合成，ANGPTL4抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)活性，使LPL催化血液中乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)所攜帶的甘油三酯(TG)水解成甘油和脂肪酸受阻，從而阻礙TG沉積到脂肪細胞[22-24]。其次，進入血液通過激活G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)和抑制組蛋白去乙?；?HDAC)調(diào)控基因的表達調(diào)控多種代謝信號通路，激活GPR41和GPR109A使能量消耗增加、耗氧量增加、瘦素表達增加、TG含量降低[25]。Gao等[26]研究發(fā)現(xiàn)，飲食補充丁酸可預(yù)防和治療飲食誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗，其作用機制與促進能量消耗和誘導(dǎo)線粒體功能有關(guān)。因此，在本研究中，金華豬體重顯著低于長白豬，背膘后卻顯著高于長白豬[12]，高脂金華豬和低脂長白豬可能與腸道中的丁酸代謝差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

① 金華豬和長白豬主要在小腸段存在腸道產(chǎn)丁酸菌相對豐度差異，金華豬空腸和回腸中產(chǎn)丁酸菌相對豐度顯著低于長白豬，且金華豬結(jié)腸段產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量顯著低于長白豬，與之相對應(yīng)的是金華豬空腸、回腸和結(jié)腸中丁酸含量顯著低于長白豬。

② 金華豬和長白豬腸道中產(chǎn)丁酸菌與產(chǎn)丁酸關(guān)鍵功能基因相對表達量和丁酸含量呈顯著正相關(guān)；丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因相對表達量也與丁酸含量呈顯著正相關(guān)，且長白豬相關(guān)系數(shù)均高于金華豬，這也在一定程度上解釋了長白豬腸道丁酸含量高于金華豬的原因。