程遠(yuǎn)之 周洪彬 虞財(cái)華 張佩發(fā) 路則慶 汪以真 王騰浩,4*

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，生物飼料安全與污染防控國家工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華東動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省飼料與動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058；2.大連成三畜牧業(yè)有限公司，大連 116308；3.上海新農(nóng)飼料股份有限公司，上海 201604；4.浙江青蓮食品股份有限公司，嘉興 314317)

畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗生素的大量使用引發(fā)了環(huán)境污染、細(xì)菌耐藥性等一系列公共衛(wèi)生問題，尋找抗生素替代品已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。酸化劑是一類無毒、無污染、無耐藥性的保健型添加劑，飼糧添加酸化劑可有效降低動(dòng)物胃腸道pH[1]，提高胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶的活性[2]，從而提高飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，促進(jìn)畜禽生長。酸化劑分為無機(jī)酸和有機(jī)酸，養(yǎng)殖生產(chǎn)中主要使用的無機(jī)酸是磷酸，其優(yōu)點(diǎn)是酸性較強(qiáng)、添加成本較低，但無機(jī)酸的使用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物食道和胃內(nèi)pH急劇下降，可能造成消化道灼傷、胃酸分泌和胃功能發(fā)育障礙；而生產(chǎn)中常用的有機(jī)酸主要包括富馬酸、檸檬酸、蘋果酸以及乳酸等大分子有機(jī)酸和甲酸、乙酸和丙酸等小分子有機(jī)酸，其優(yōu)點(diǎn)是能夠改善飼糧適口性，對(duì)機(jī)體刺激較低，但添加成本相對(duì)較高。有機(jī)酸中，乳酸廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，可直接參與代謝循環(huán)，飼糧添加乳酸具有良好的風(fēng)味與抗菌活性[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，仔豬早期斷奶后，胃內(nèi)pH升高，胃蛋白酶等消化酶活性降低，容易導(dǎo)致仔豬消化不良、生長受阻和免疫功能受損，易患“仔豬斷奶應(yīng)激綜合征”[4]。因此，本試驗(yàn)使用了2種新型酸化劑，分別是經(jīng)鈍化處理的磷酸型酸化劑和復(fù)合組成的乳酸型酸化劑，旨在研究二者在飼糧中不添加抗生素的情況下，對(duì)斷奶仔豬胃腸道酸性環(huán)境的改善作用，以及對(duì)斷奶仔豬生長性能、消化酶活性、抗氧化功能及免疫功能的影響，從而為促進(jìn)仔豬生長和改善仔豬消化功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的磷酸型酸化劑主要成分為磷酸(經(jīng)鈍化處理)，與二氧化硅比例為50∶50；乳酸型酸化劑由乳酸、檸檬酸和甲酸等復(fù)合組成，其中乳酸占總酸的70%，與二氧化硅的比例為50∶50。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選用體重[(7.14±0.30) kg]相近的30日齡斷奶仔豬162頭，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18頭。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組則在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.2%磷酸型酸化劑和0.2%乳酸型酸化劑，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表2，所有仔豬飼糧中均未添加抗生素。試驗(yàn)在規(guī)?；i場(chǎng)開展，豬欄采用自動(dòng)喂料槽、鴨嘴式飲水器，仔豬自由采食與飲水。斷奶仔豬轉(zhuǎn)入試驗(yàn)欄后，進(jìn)行預(yù)試期1周，預(yù)試期內(nèi)進(jìn)行編號(hào)、分組。試驗(yàn)期間每天記錄豬舍溫度和濕度，免疫和驅(qū)蟲按照養(yǎng)殖場(chǎng)的管理程序進(jìn)行。試驗(yàn)期21 d。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生長性能

試驗(yàn)開始前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)豬空腹12 h稱重，分別記為初重和末重，根據(jù)試驗(yàn)天數(shù)計(jì)算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 屠宰及樣品采集

試驗(yàn)豬屠宰前禁食12 h(自由飲水)，屠宰后進(jìn)行樣品采集。血清：前腔靜脈采血于促凝管中，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，吸取上清并分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃保存。腸道樣品：分別取十二指腸、中段空腸、遠(yuǎn)端回腸、中段結(jié)腸各5小塊于樣品袋中，液氮速凍，-80 ℃保存。另各取胃、十二指腸、中段空腸、遠(yuǎn)端回腸、中段結(jié)腸、盲腸1小段并結(jié)扎，4 ℃保存用于測(cè)定pH。

1.3.3 血清生化指標(biāo)

血清堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及乳酸脫氫酶(LDH)活性以及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)含量采用全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi 7600)測(cè)定。

1.3.4 胃腸道內(nèi)容物pH及消化酶活性

胃腸道內(nèi)容物pH采用pH計(jì)(Mettler-Toledo S210-S)測(cè)定，淀粉酶、脂肪酶活性測(cè)定所需試劑盒購自南京建成生物工程研究所，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.5 血清抗氧化指標(biāo)

血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量測(cè)定所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.6 血清免疫指標(biāo)

血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量采用免疫透射比濁法結(jié)合全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi 7600)測(cè)定。

1.3.7 腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)腸道免疫相關(guān)基因白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA相對(duì)表達(dá)量。采用Trizol試劑提取十二指腸、空腸黏膜中總RNA，根據(jù)cDNA合成試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]合成cDNA，-20 ℃保存。選用β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)標(biāo)參照，目的基因及β-actin引物序列見表3(由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成)。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行測(cè)定。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)處理，采用Turkey法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，磷酸型酸化劑組和乳酸型酸化劑組斷奶仔豬平均日采食量分別提高了6.75%和11.69%(P>0.05)，平均日增重分別提高了10.67%和13.07%(P>0.05)，料重比分別降低了3.40%和1.36%(P>0.05)，這表明飼糧添加0.2%磷酸型酸化劑和0.2%乳酸型酸化劑有提高斷奶仔豬生長性能、降低料重比的趨勢(shì)。

表4 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，磷酸型酸化劑組和乳酸型酸化劑組斷奶仔豬血清LDH活性分別顯著降低了41.88%和39.05%(P<0.05)；此外，磷酸型酸化劑組斷奶仔豬血清AST活性顯著降低(P<0.05)，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬血清ALT活性顯著降低(P<0.05)；而飼糧添加不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬血清TP、ALB和GLB含量、白球比以及ALP活性無顯著影響(P>0.05)，但磷酸型酸化劑組斷奶仔豬血清TP含量顯著高于乳酸型酸化劑組(P<0.05)。

表5 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

2.3 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬胃腸道內(nèi)容物pH及消化酶活性的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬十二指腸和空腸內(nèi)容物pH顯著降低(P<0.05)，而磷酸型酸化劑組斷奶仔豬十二指腸和空腸內(nèi)容物pH無顯著差異(P>0.05)；此外，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬空腸內(nèi)容物pH顯著低于磷酸型酸化劑組(P<0.05)；而飼糧添加不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬胃、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物pH均無顯著影響(P>0.05)。

表6 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬胃腸道內(nèi)容物pH的影響

由表7可知，與對(duì)照組相比，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬十二指腸內(nèi)容物淀粉酶活性顯著提高(P<0.05)，磷酸型酸化劑組和乳酸型酸化劑組斷奶仔豬十二指腸內(nèi)容物脂肪酶活性均有所提高，其中乳酸型酸化劑組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；乳酸型酸化劑組斷奶仔豬空腸內(nèi)容物淀粉酶和脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組和磷酸型酸化劑組(P<0.05)。

表7 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬腸道內(nèi)容物消化酶活性的影響

2.4 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表8可知，與對(duì)照組相比，磷酸型酸化劑組和乳酸型酸化劑組斷奶仔豬血清T-SOD活性分別提高了11.20%(P>0.05)和24.55%(P<0.05)；同時(shí)，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬血清MDA含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；此外，飼糧添加0.2%乳酸型酸化劑一定程度上提高了斷奶仔豬血清GSH-Px活性(P>0.05)。

表8 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表9可知，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬血清IgG含量顯著高于對(duì)照組和磷酸型酸化劑組(P<0.05)，而磷酸型酸化劑組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；同時(shí)，與對(duì)照組相比，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬血清IgA含量顯著提高(P<0.05)，而與磷酸型酸化劑組無顯著差異(P>0.05)。

表9 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

2.6 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖1可知，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬十二指腸IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和磷酸型酸化劑組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，乳酸型酸化劑組斷奶仔豬十二指腸TGF-βmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，而磷酸型酸化劑組無顯著差異(P>0.05)。乳酸型酸化劑組斷奶仔豬空腸TGF-β和TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和磷酸型酸化劑組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬胃腸道內(nèi)容物消化酶活性和生長性能的影響

斷奶早期仔豬消化系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，胃腸道各種消化酶分泌不足，再加上仔豬胃中鹽酸分泌不足，使得胃腸道pH升高，從而無法激活胃蛋白酶等消化酶，導(dǎo)致仔豬無法有效地消化飼糧中的蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)[5]。酸化劑改善動(dòng)物腸道健康的機(jī)理主要是通過降低飼糧的pH，從而降低動(dòng)物胃腸道pH，提高胃蛋白酶等消化酶的活性，維持機(jī)體胃腸道最佳的消化環(huán)境[6]。Risley等[7]在飼糧中添加1.5%的檸檬酸后，斷奶仔豬胃內(nèi)容物pH下降了0.25。Radcliffe等[8]同樣發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸可以改善斷奶仔豬的生長性能并降低胃腸道pH，且效果與李運(yùn)虎等[9]研究結(jié)果相同。Partanen等[10]發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸及其鹽可以改善動(dòng)物消化道環(huán)境，促進(jìn)消化，從而緩解斷奶仔豬腹瀉。王繼華等[11]研究表明，將檸檬酸鈣、乳酸鈣與1.5%檸檬酸配伍能提高斷奶仔豬生長性能。但另有研究表明，添加無機(jī)型酸化劑易導(dǎo)致胃內(nèi)pH急劇下降，抑制胃酸分泌，從而影響胃部功能[12]。本試驗(yàn)中，飼糧添加0.2%磷酸型酸化劑后，斷奶仔豬胃內(nèi)pH與對(duì)照組結(jié)果相近，而十二指腸和空腸pH明顯降低，這提示磷酸經(jīng)鈍化處理后，有效克服了無機(jī)型酸化劑在胃中釋放速度過快的缺陷，能夠更好地在腸道內(nèi)發(fā)揮作用。本試驗(yàn)中，飼糧添加0.2%乳酸型酸化劑后，斷奶仔豬胃、十二指腸和空腸pH均明顯降低，且斷奶仔豬十二指腸和空腸淀粉酶和脂肪酶活性均顯著提高。

通過改善仔豬消化酶活性，能夠有效提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，進(jìn)而促進(jìn)仔豬生長。Partanen等[13]研究表明，飼糧添加3 g/kg甲酸和乳酸的復(fù)合物可提高肥育豬的平均日增重和整個(gè)育肥期的增重，且飼料轉(zhuǎn)化率隨添加量的增加而提高。Wang等[14]研究表明，飼糧添加0.4%竹醋液和0.25%酸化劑可提高斷奶仔豬平均日采食量和平均日增重，降低料重比，效果與添加抗生素相當(dāng)。本試驗(yàn)中，飼糧添加0.2%磷酸型酸化劑和0.2%乳酸型酸化劑后，斷奶仔豬平均日采食量分別提高了6.75%和11.69%，平均日增重分別提高了10.67%和13.07%，這表明不同類型酸化劑具有提高斷奶仔豬生長性能的趨勢(shì)。

3.2 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬抗氧化功能的影響

機(jī)體內(nèi)過多的氧自由基會(huì)攻擊細(xì)胞生物膜，破壞機(jī)體氧化-還原系統(tǒng)。氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化過程中，會(huì)產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物，其水平可以直接反映機(jī)體受脂質(zhì)過氧化損傷程度。本試驗(yàn)中，飼糧添加0.2%乳酸型酸化劑可以顯著降低斷奶仔豬血清MDA含量。同時(shí)，超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px是機(jī)體抗氧化應(yīng)激酶體系中重要的2種酶。鄭建婷等[15]研究表明，飼糧添加1.5%檸檬酸可以提高生長肉兔血清SOD活性。李建平等[16]研究表明，飼糧添加檸檬酸可顯著提高斷奶仔豬血清SOD活性和總抗氧化能力，且斷奶2周內(nèi)添加效果優(yōu)于斷奶2周后。此外，陽巧梅等[17]研究表明，飼糧添加0.2%復(fù)合有機(jī)酸A(丁酸、山梨酸和C12脂肪酸)可顯著降低斷奶仔豬血液中自由基的含量，效果優(yōu)于添加25 mg/kg金霉素。本試驗(yàn)中，飼糧添加0.2%乳酸型酸化劑可以顯著提高斷奶仔豬血清T-SOD活性，說明乳酸型酸化劑可以提高斷奶仔豬的抗氧化能力，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激造成的損傷。

3.3 不同類型酸化劑對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

免疫球蛋白是高等動(dòng)物免疫淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在抗原刺激下可以轉(zhuǎn)化為抗體，發(fā)揮抗病原菌和病毒等免疫功能，主要分為IgG、IgM、IgA、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)5種。李鵬等[18]研究表明，飼糧添加磷酸型酸化劑和乳酸型酸化劑均可顯著提高斷奶仔豬血清IgG和IgA含量。Ahmed等[19]研究表明，飼喂含0.5%檸檬酸或0.4%酸化劑混合物的斷奶仔豬血清IgG含量顯著高于基礎(chǔ)飼糧組和抗生素組，但血清IgM和IgA含量無顯著變化。陽巧梅等[17]研究表明，飼糧添加0.2%復(fù)合有機(jī)酸B(甲酸、乙酸、丙酸和C12脂肪酸)可顯著提高斷奶仔豬血清IgM含量。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.2%磷酸型酸化劑有提高斷奶仔豬血清IgG、IgM和IgA含量的趨勢(shì)，而添加0.2%乳酸型酸化劑則可以顯著提高斷奶仔豬血清IgG和IgA含量。

細(xì)胞因子在機(jī)體先天和后天免疫中扮演著重要的角色，病原微生物的入侵會(huì)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促使機(jī)體分泌炎癥因子，以清除入侵的病原菌。Reda等[20]研究表明，飼料添加2 g/kg復(fù)合有機(jī)酸能夠提高羅非魚肝臟和腎臟中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α的基因表達(dá)量。Yin等[21]研究表明，斷奶仔豬感染沙門氏菌后，機(jī)體IL-10含量顯著升高，而飼喂乳酸菌發(fā)酵飼糧則顯著減少了仔豬腹瀉和腸道內(nèi)沙門氏菌數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，斷奶仔豬飼糧中添加0.2%乳酸型酸化劑后，十二指腸中IL-10、TGF-β和空腸中TGF-β、TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，這提示乳酸型酸化劑可以通過提高免疫球蛋白含量和誘導(dǎo)免疫因子的表達(dá)來增強(qiáng)斷奶仔豬的免疫功能。

4 結(jié) 論

在斷奶仔豬飼糧中添加0.2%磷酸型酸化劑和0.2%乳酸型酸化劑具有提高斷奶仔豬平均日采食量和平均日增重、降低料重比的趨勢(shì)。乳酸型酸化劑可以顯著提高血清抗氧化酶活性和免疫球蛋白的含量，提高十二指腸和空腸免疫因子的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化和免疫功能，乳酸型酸化劑效果優(yōu)于磷酸型酸化劑。