殷運(yùn)菊 閆昭明 陳清華* 劉明峰

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.山東隆科特酶制劑有限公司，沂水 276400)

甘露聚糖是存在于植物性飼料中的一類抗?fàn)I養(yǎng)因子，畜禽采食后會增加消化道內(nèi)食糜黏度，影響畜禽對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率降低[1]。已知β-甘露聚糖酶由多種細(xì)菌、真菌、放線菌、植物和動物產(chǎn)生[2-3]，從微生物中提取的β-甘露聚糖酶因其低成本、易獲得和高活性等特性[1]，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]，目前已在制漿造紙、制藥、食品、石油和紡織工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[1,5-9]。在飼糧中加入β-甘露聚糖酶，可使細(xì)胞壁中甘露聚糖分解，并促進(jìn)被細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)包裹的營養(yǎng)物質(zhì)釋放，降低消化道內(nèi)食糜黏度，增加十二指腸和空腸絨毛的高度，從而使表面積增大，提升動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[10]，達(dá)到提高植物性原料的消化利用率和改善動物生產(chǎn)性能的效果。本文主要從β-甘露聚糖酶的酶學(xué)特性以及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為β-甘露聚糖酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 甘露聚糖與甘露聚糖酶

在植物性原料中，甘露聚糖是高等植物細(xì)胞壁中半纖維素的主要成分之一，它包括由D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖等單糖合成的線性或支鏈聚合物[11]。甘露聚糖可分為線性甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖(圖1)，從結(jié)構(gòu)上看，這些多糖均含有甘露糖或葡萄糖和甘露糖殘基組合而成的β-1,4-主鏈[12]。此外，甘露聚糖主鏈可以被側(cè)鏈的半乳糖α-1,6-連鎖殘基取代[13]。由于甘露聚糖具有黏度、表面活性及持水性等物理特性，因此單胃動物采食后會產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)作用。甘露聚糖抗?fàn)I養(yǎng)作用表現(xiàn)在以下幾個方面：一是在畜禽消化道內(nèi)甘露聚糖溶于水后易形成凝膠狀，增加食糜黏度，造成動物飽腹感增加并降低采食量，從而降低生長性能；二是甘露聚糖具有高持水活性，可吸收大量水分，使其物理特性發(fā)生改變，抑制腸道的蠕動；三是甘露聚糖的高親水性使其易與腸黏膜上的脂類微團(tuán)及多糖蛋白復(fù)合物產(chǎn)生相互作用，導(dǎo)致腸黏膜表面水層變厚，降低營養(yǎng)物質(zhì)吸收；四是未消化的非淀粉多糖(non-starch polysaccharide，NSP)如甘露聚糖等在消化道內(nèi)沉積，使消化道后段微生物厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生大量毒素，引起消化道微生物群落的紊亂并抑制動物生長；五是在消化液中甘露聚糖極易與飼糧中帶相反電荷的營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[14-15]。

圖1 甘露聚糖分類

各種構(gòu)型的甘露聚糖是真菌、細(xì)菌和病毒等許多病原體的表面成分，可以刺激腸道上皮中先天免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞[1,16]，先天免疫細(xì)胞通過病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)來識別病原體，并與先天免疫細(xì)胞中的受體結(jié)合激活該類細(xì)胞[17]。因此，飼糧中的甘露聚糖會發(fā)出腸道中存在病原體的錯誤信號，引發(fā)不合理的免疫激活，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖增加，并由此產(chǎn)生細(xì)胞因子，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)以及降低營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率[18]；同時，甘露聚糖使葡萄糖吸收利用率降低，抑制了胰島素的分泌及胰島素樣生長因子-Ⅰ的表達(dá)，從而影響動物機(jī)體對能量的利用[18-19]。甘露聚糖的水解可以消除腸道中的這一錯誤信號，使巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，血糖濃度升高[18,20]。

β-甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，能破壞甘露聚糖主鏈的內(nèi)部糖苷鍵，釋放結(jié)構(gòu)較短的1,4-甘露低聚糖。根據(jù)β-甘露聚糖酶的氨基酸序列，將其主要分為糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase family，GH)5、26和113。GH5和GH26都屬于最大的糖苷水解酶家族——GH-A。GH-A酶家族具有TIM(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)和保留反應(yīng)機(jī)制[21]，TIM(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)由10股β-鏈和13個α-螺旋組成，包括3個310-螺旋(殘基60～62、64～66和289～294)。β-片狀結(jié)構(gòu)由8條位于中部的平行β-鏈(黃色)組成，形成1個被8個大小為4.5 nm×4.5 nm×4.0 nm的α-螺旋(紅色)包圍的圓筒(圖2)。β-甘露聚糖酶的活性位點(diǎn)是位于第4個和第7個β折疊的C末端的2個谷氨酸，分別作為酸堿催化位點(diǎn)和親核催化位點(diǎn)，在所有的β-甘露聚糖酶中絕對保守[21-22]。通常情況下，除了催化模塊之外，β-甘露聚糖酶還攜帶額外的模塊，最常見的是碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module，CBM)。CBM根據(jù)序列相似性和三維結(jié)構(gòu)至少被分為53個家族。一些β-甘露聚糖酶含有甘露聚糖結(jié)合的CBM，對這些模塊的結(jié)構(gòu)研究為深入了解甘露聚糖主干識別和側(cè)基調(diào)節(jié)機(jī)制提供了依據(jù)。另一些含有纖維素結(jié)合的CBM，可顯著增加不溶性甘露聚糖纖維素復(fù)合物的水解[1，21]。

圖2 β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)

β-甘露聚糖酶在自然界中普遍存在，已從細(xì)菌、真菌、放線菌、植物和動物中分離出來(表1)，飼用β-甘露聚糖酶主要來源于微生物[15]，主要原因?yàn)榘饷赶蛋踩雀摺⒁撰@取等；其培養(yǎng)及生產(chǎn)方式主要為深層發(fā)酵(submerged fermentation，SMF)和固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation，SSF)2種。

表1 β-甘露聚糖酶的來源

2 β-甘露聚糖酶的酶學(xué)特性

國內(nèi)外研究學(xué)者通常采用有機(jī)溶劑沉淀、雙水相萃取、層析和離子交換等方法對β-甘露聚糖酶進(jìn)行分離純化[34]。β-甘露聚糖酶活性的測定方法有：黏度法、還原糖法以及色原底物法；其中還原糖法中的二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)比色法因其方法成熟、操作簡單和顯色穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，在β-甘露聚糖酶活性測定中被廣泛使用[35-36]。

不同來源的β-甘露聚糖酶構(gòu)成不同，它們的相對分子質(zhì)量、酶動力學(xué)特性和作用方式也有所不同。β-甘露聚糖酶的最適pH大多數(shù)在4.0～7.0，最適溫度在40～65 ℃，小于或高于最適溫度，大多數(shù)酶不穩(wěn)定。Soni等[37]對土壤曲霉固態(tài)培養(yǎng)物中提取的β-甘露聚糖酶進(jìn)行研究，結(jié)果表明純化的β-甘露聚糖酶的活性為53.75 U/mg，分子質(zhì)量為49 ku，最佳pH為7.0，最佳溫度為70 ℃。You等[38]對從腸桿菌屬N18中分離的β-甘露聚糖酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)β-甘露聚糖酶分子質(zhì)量為90 ku；以0.5%瓜爾膠、魔芋粉、豆膠(locust bean gum，LBG)、黃原膠和羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC)作為底物測定β-甘露聚糖酶活性，結(jié)果顯示LBG作為底物時，β-甘露聚糖酶活性最高，為(8 132±39) U/mg；β-甘露聚糖酶在最佳溫度50 ℃(pH=7.0)時超過75%的活性，而在70 ℃時還保留40%以上的活性；一些因素可影響β-甘露聚糖酶的活性，例如1 mmol/L汞離子(Hg2+)顯著抑制酶活性，1 mmol/L鈣離子(Ca2+)、鎳離子(Ni2+)、銅離子(Cu2+)、鐵離子(Fe3+)、鋅離子(Zn2+)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和10%乙醇也可抑制酶活性，而1 mmol/L鈷離子(Co2+)、亞鐵離子(Fe2+)和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)能顯著提高β-甘露聚糖酶的活性。

為解決β-甘露聚糖酶在生產(chǎn)應(yīng)用中存在的問題，大量內(nèi)源β-甘露聚糖酶基因已被克隆并在外源宿主中表達(dá)，主要以原核和真核2種外源表達(dá)系統(tǒng)為主[39]。源自細(xì)菌的內(nèi)源β-甘露聚糖酶的基因通常在大腸桿菌表達(dá)[40]，而真菌來源的β-甘露聚糖酶基因常在帕斯氏酵母和曲霉中表達(dá)[41]。原核和真核生物中的內(nèi)源β-甘露聚糖酶基因大小在978～2 010 kb。完全成熟的重組內(nèi)源β-甘露聚糖酶蛋白含有326～669個氨基酸殘基。從芽孢桿菌屬和曲霉真菌屬中獲得的內(nèi)源β-甘露聚糖酶，克隆和表達(dá)后獲得最高酶活性為1 575 U/mL[16]。對枯草桿菌MA139的β-甘露聚糖酶基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，得到的重組酶具有較高的酶活性[42]。

3 β-甘露聚糖酶在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 在家禽生產(chǎn)上的應(yīng)用

研究表明，在家禽飼糧中添加β-甘露聚糖酶可以提高家禽生長性能和免疫力[43-44]。Jackson等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加80或110 MU/t的β-甘露聚糖酶時，肉雞的增重和飼料效率都有所提高，而添加50 MU/t的β-甘露聚糖酶沒有顯著效果。Zheng等[45]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加β-甘露聚糖酶可提高蛋雞產(chǎn)蛋前期的采食量、產(chǎn)蛋率以及雞蛋質(zhì)量；同時，飼糧添加β-甘露聚糖酶還可增加蛋雞盲腸中乳酸菌數(shù)量，降低氨濃度。β-甘露聚糖酶提高免疫力的一個可能原因是甘露聚糖被降解為甘露寡糖(mannan oligosaccharide，MOS)[43]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加β-甘露聚糖酶可降低胸腺和法氏囊相對權(quán)重以及血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量，β-甘露聚糖酶可抑制由甘露聚糖引起的動物免疫反應(yīng)，從而減少動物機(jī)體免疫反應(yīng)[46]。也有研究表明，在肉雞飼糧中添加β-甘露聚糖酶增加了淋巴細(xì)胞數(shù)量，降低了異核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比(H∶L)，從而改善雞的免疫系統(tǒng)能力[47]。

甘露聚糖具有黏度，可通過減慢胃腸排空、削弱底物與消化酶的結(jié)合以及降低營養(yǎng)物質(zhì)與小腸上皮的接觸速率造成營養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用減少[48]。Mehri等[47]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加900 g/t的β-甘露聚糖酶可顯著提高小腸絨毛高度、杯狀細(xì)胞數(shù)量、小腸不同部位的隱窩深度和上皮厚度。研究表明，β-甘露聚糖酶提高飼料利用率主要通過3個途徑來實(shí)現(xiàn)：一是β-甘露聚糖酶分解細(xì)胞壁基質(zhì)，促進(jìn)被細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)包裹營養(yǎng)物質(zhì)的釋放；二是降低食糜黏度，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率；三是促進(jìn)十二指腸和空腸絨毛高度的增加，增大吸收表面積，改善腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率[10]。

3.2 在豬生產(chǎn)上的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加β-甘露聚糖酶可以提高生長豬和育肥豬的生長性能[49-50]，還可以提高哺乳母豬乳脂水平及乳糖含量[51]。Kim等[52]研究發(fā)現(xiàn)，在生長豬飼糧中添加400 U/kg的β-甘露聚糖酶能提高其對營養(yǎng)物質(zhì)消化率以及血糖濃度，營養(yǎng)物質(zhì)消化率提高可能是由于β-甘露聚糖酶的水解作用增加了細(xì)胞壁的通透性，切斷了長鏈多糖，從而加速了營養(yǎng)物質(zhì)的消化。血糖濃度的提高是由于NSP在后腸被β-甘露聚糖酶分解發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，而揮發(fā)性脂肪酸可代替葡萄糖發(fā)揮能源作用。Jeon等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加0.5 g/kg的β-甘露聚糖酶可提高生長豬平均日增重(ADG)以及標(biāo)準(zhǔn)回腸氨基酸消化率，因而降低豬糞便氨濃度。Upadhaya等[54]在飼糧中添加0.05%的β-甘露聚糖酶，可減少生長豬腸道中大腸桿菌數(shù)量。而消化道中微生物的種類和數(shù)量是影響營養(yǎng)物質(zhì)消化率和腸道健康狀況的重要因素，乳酸菌被認(rèn)為是有益于腸道的細(xì)菌，而大腸菌則被認(rèn)為可以引起腹瀉等腸道健康問題[54]，因此β-甘露聚糖酶可以改善動物腸道健康。丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量是衡量機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，β-甘露聚糖酶在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用有助于提高仔豬機(jī)體抗氧化能力，其主要原因是補(bǔ)充β-甘露聚糖酶降低了空腸中MDA的含量[55]。

3.3 在反芻動物生產(chǎn)上的應(yīng)用

研究表明，β-甘露聚糖酶可以提高反芻動物的生產(chǎn)性能和免疫力。Lee等[56]在山羊飼糧中添加0.1%的β-甘露聚糖酶可以提高其飼料轉(zhuǎn)化率及ADG。Azevedo等[57]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼糧添加0.1%β-甘露聚糖酶可降低奶牛血清結(jié)合珠蛋白濃度。結(jié)合珠蛋白作為反芻動物主要的急性期蛋白(acute phase protein，APP)，可用于檢測全身性炎癥的發(fā)作，包括乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和肺炎。因此，補(bǔ)充β-甘露聚糖酶可能通過減少急性期反應(yīng)而發(fā)揮抗炎作用。奶牛飼喂β-甘露聚糖酶后，對其血清進(jìn)行生化分析發(fā)現(xiàn)：血清中IgG含量和CD4/CD8值在數(shù)值上較高；因此，飼糧添加β-甘露聚糖酶有提高泌乳奶牛免疫力的潛力。Roque等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.1%β-甘露聚糖酶不僅能發(fā)揮抗炎作用，降低潛在的免疫激活，改善奶牛的能量平衡，還能減少奶牛每次成功受孕所需的授精次數(shù)。

4 小 結(jié)

β-甘露聚糖酶作為一種環(huán)保的飼料添加劑已經(jīng)應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中。β-甘露聚糖酶通過水解NSP中的甘露聚糖，使植物性飼料中的營養(yǎng)成分充分釋放，有利于動物消化吸收。同時，補(bǔ)充β-甘露聚糖酶還能消除飼糧中甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，降低消化道食糜黏性，從而提高飼糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率，并達(dá)到保護(hù)環(huán)境的目的。目前，我國在β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)研究中已獲得重大突破和進(jìn)展，但其生產(chǎn)和穩(wěn)定化技術(shù)還未發(fā)展成熟，從而限制其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。因此，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對β-甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)及菌種改良的研究。除通過蛋白質(zhì)工程改造β-甘露聚糖酶制劑性能，如提高酶活力、耐溫和耐酸性等；還應(yīng)繼續(xù)從動物、植物及微生物中尋找更多優(yōu)質(zhì)β-甘露聚糖酶來源，同時加深對其結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制的認(rèn)識，推動其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。