萬(wàn) 凡 侯扶江 伊 寶 張宏福

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730020)

隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)?；⒓s化的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境污染等問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，由此影響畜禽健康，導(dǎo)致動(dòng)物免疫力低下、易受病原菌侵襲等。在畜禽飼糧中添加抗生素可以增強(qiáng)動(dòng)物自身免疫力，但卻導(dǎo)致抗生素殘留和細(xì)菌耐藥性等問(wèn)題，嚴(yán)重危害畜禽養(yǎng)殖環(huán)境和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。因此，開(kāi)發(fā)安全高效、無(wú)殘留的新型飼料添加劑成為科研工作者的研究重點(diǎn)。綠原酸作為一種廣泛存在于天然植物中的多酚類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抑菌[3]、抗病毒[4]及抗癌[5]等生物學(xué)功能。其中，金銀花、山銀花、杜仲葉以及咖啡豆等是綠原酸的主要來(lái)源[6]。研究發(fā)現(xiàn)，添加綠原酸能夠緩解動(dòng)物腸道氧化應(yīng)激和炎癥，維持腸道穩(wěn)態(tài)和免疫機(jī)能，保障動(dòng)物腸道健康[7-8]。因此，綠原酸可作為一種潛在的增強(qiáng)動(dòng)物自身免疫力的飼料添加劑。本文就國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，簡(jiǎn)要介紹綠原酸的來(lái)源，系統(tǒng)總結(jié)綠原酸的生理功能及其可能的作用機(jī)理，并探討其作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 綠原酸

綠原酸在植物中廣泛存在，屬于苯丙烯酸(羥基肉桂酸)家族，具有6個(gè)異構(gòu)體，分別為隱綠原酸(4-咖啡?？鼘幩?、新綠原酸(5-咖啡?？鼘幩?、異綠原酸A(3,5-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸B(3,4-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸C(4,5-二咖啡?？鼘幩?和洋薊素(1,3-二咖啡酰奎寧酸)[9](圖1)。Payen[10]于1864年首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)綠原酸，其從咖啡中提取出一種物質(zhì)，約占咖啡總量的5%，發(fā)現(xiàn)該種物質(zhì)在堿性氧化物的作用下變?yōu)榫G色，并將其命名為“綠原酸”。后續(xù)有報(bào)道指出，奎寧酸和咖啡酸能合成一種白色晶體物質(zhì)，即為綠原酸，具體為奎寧酸與咖啡酸結(jié)合形成半綠原酸，2分子半綠原酸縮合，失去1分子水生成綠原酸[11]。21世紀(jì)初，隨著質(zhì)譜和高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展，綠原酸的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)逐漸被清晰認(rèn)識(shí)[12]，并且研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸具有抗氧化[1,13]、抗炎[2]、抑菌[3,6]、抗病毒[4]及抗癌[5]等多種生理功能，目前已被應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

圖1 綠原酸及其異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)

綠原酸主要提取自金銀花、山銀花、杜仲葉和元寶楓葉等中草藥的莖葉。我國(guó)中草藥資源豐富，這為綠原酸的開(kāi)發(fā)和利用提供了有力保障。據(jù)國(guó)家林業(yè)局頒布的《全國(guó)杜仲產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2016—2030年)》[14]，預(yù)計(jì)2030年，我國(guó)杜仲種植面積將達(dá)到233.33萬(wàn)hm2。杜仲植株的葉子是綠原酸的主要提取部位，不同的季節(jié)綠原酸的含量不同，以6月含量最高[15]。元寶楓是槭樹(shù)科槭樹(shù)屬的一種落葉喬木，其楓葉中含有綠原酸和黃酮等多種活性成分，與杜仲類(lèi)似，6月份綠原酸含量最高，可達(dá)4%左右[16]。此外，忍冬科植物山銀花(又名山花)廣泛分布于我國(guó)南方各地，尤其在四川、廣東和廣西等地，也是綠原酸的重要來(lái)源之一。

2 綠原酸在動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑

綠原酸在動(dòng)物胃和小腸中，主要代謝生成咖啡酸和奎寧酸[6]。研究表明，只有約1/3綠原酸在胃和小腸被吸收，其主要原因在于綠原酸的親水性使其較難通過(guò)親脂性的膜屏障[17]。細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠原酸及其異構(gòu)體在胃上皮細(xì)胞的吸收機(jī)制，發(fā)現(xiàn)均以細(xì)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)、被動(dòng)擴(kuò)散方式吸收，其中異綠原酸(異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C)、綠原酸、新綠原酸以及隱綠原酸的表觀滲透系數(shù)約為0.2 cm/s，時(shí)間和濃度梯度呈線性關(guān)系[18]。另外，大鼠胃結(jié)扎后灌服綠原酸，在胃的靜脈和主動(dòng)脈均檢測(cè)到綠原酸[19]，這也證實(shí)了綠原酸在胃內(nèi)以原型被吸收。Stalmach等[20]研究發(fā)現(xiàn)，給健康人飲用咖啡(含有412 μmol的綠原酸)后1 h，在血漿中檢測(cè)到綠原酸的代謝產(chǎn)物咖啡酸-3′-硫酸鹽、阿魏酸-4′-硫酸鹽以及3-O-咖啡酰基奎寧內(nèi)酯硫酸鹽，說(shuō)明綠原酸在小腸中發(fā)生分解。而小鼠小腸灌注綠原酸，發(fā)現(xiàn)部分綠原酸在小腸中被糖苷酶和酯酶分解，酯鍵斷裂生成奎寧酸和咖啡酸[21]；其中部分咖啡酸被腸道吸收，通過(guò)肝腸循環(huán)進(jìn)入肝臟，咖啡酸的羥基兒茶酚鄰位在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生甲基化，形成鄰位羥基-甲氧基，轉(zhuǎn)化為阿魏酸和異阿魏酸[21]。部分阿魏酸在還原酶的作用下生成二氫阿魏酸，阿魏酸、異阿魏酸以及二氫阿魏酸由肝靜脈進(jìn)入血液循環(huán)[21-22]，部分發(fā)生硫酸鹽化，分別生成阿魏酸-4′-硫酸鹽、異阿魏酸-4′-硫酸鹽以及二氫阿魏酸-4′-硫酸鹽[21]。另外，小鼠小腸灌注綠原酸，在血漿中并未檢測(cè)到奎寧酸及其代謝產(chǎn)物，可能是奎寧酸并未在小腸中被吸收，而是在結(jié)腸被腸道菌群代謝[23]。再者，小腸中部分綠原酸被腸道直接吸收，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)生硫酸鹽化反應(yīng)生成硫酸鹽代謝產(chǎn)物[6,24]。

未被胃和小腸吸收的綠原酸直接進(jìn)入大腸，約占總量的2/3，結(jié)腸對(duì)其代謝和吸收發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。大部分綠原酸在結(jié)腸被大腸桿菌、雙歧桿菌和加氏乳桿菌等菌群產(chǎn)生的酯酶水解生成咖啡酸和奎寧酸[23]。還有部分綠原酸發(fā)生酯基位置異構(gòu)形成新綠原酸和隱綠原酸，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)生硫酸鹽化反應(yīng)分別生成5-O-咖啡?；鼘巸?nèi)酯硫酸鹽和4-O-咖啡?；鼘巸?nèi)酯硫酸鹽[21]。綠原酸分解生成的咖啡酸有2種代謝途徑：1)通過(guò)細(xì)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)和被動(dòng)擴(kuò)散方式吸收[22]，進(jìn)入肝臟進(jìn)行后續(xù)代謝[25]，在肝臟中還原酶作用下發(fā)生氫化作用生成二氫咖啡酸，二氫咖啡酸通過(guò)肝靜脈進(jìn)入血液循環(huán)，部分二氫咖啡酸發(fā)生硫酸鹽化，生成二氫咖啡酸-3′-硫酸鹽[23]，或者與小腸中咖啡酸進(jìn)入肝臟代謝途徑相同[23]；2)未被腸道吸收的一部分咖啡酸由腸道菌群作用發(fā)生甲基化反應(yīng)生成阿魏酸和異阿魏酸，而后被腸道直接吸收，進(jìn)入血液循環(huán)，發(fā)生硫酸鹽化反應(yīng)，分別生成阿魏酸-4′-硫酸鹽和異阿魏酸-4′-硫酸鹽[22]。還有一種途徑是阿魏酸、異阿魏酸以及腸道中未降解的咖啡酸在腸道中發(fā)生葡糖苷酸化代謝，以葡糖苷酸化形式吸收[26]。綠原酸分解生成的奎寧酸在結(jié)腸微生物的作用下，代謝產(chǎn)生馬尿酸和香豆素[27]。其中馬尿酸的生成途徑為：奎寧酸在腸道菌群的作用下首先脫去1分子水形成莽草酸，而后莽草酸脫甲基形成苯甲酸，苯甲酸與甘氨酸結(jié)合形成馬尿酸隨尿液排出體外[27]?？鼘幩岱纸馍傻南愣顾乇荒c道直接吸收進(jìn)入血液循環(huán)。研究證實(shí)，口服綠原酸，在動(dòng)物的血漿和尿液中均檢測(cè)到綠原酸的代謝產(chǎn)物阿魏酸、馬尿酸以及香豆素[19]。另外，酯化后生成的新綠原酸在兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶作用下發(fā)生甲基化反應(yīng)生成5-阿魏?？鼘幩?，進(jìn)而被腸道微生物產(chǎn)生的酯酶水解形成阿魏酸和奎寧酸。后續(xù)代謝途徑與上述相同[22]。綜上所述，綠原酸在體內(nèi)的主要代謝途徑如圖2所示。

圖2 綠原酸的主要代謝途徑

3 綠原酸的生理功能及其作用機(jī)理

3.1 抗氧化

酚類(lèi)物質(zhì)因含有酚羥基而具有抗氧化作用，羥基的位置和數(shù)量決定酚類(lèi)物質(zhì)抗氧化能力的強(qiáng)弱。綠原酸分子結(jié)構(gòu)包含5個(gè)酚羥基和1個(gè)羧基，其中酚羥基易與自由基發(fā)生反應(yīng)，形成具有抗氧化作用的氫自由基，因此，綠原酸具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化的生物學(xué)功能[28]。細(xì)胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1，CYP2E1)和細(xì)胞色素P450 4A(cytochrome P450 4A，CYP4A)均屬于細(xì)胞色素P450[29]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，CYP2E1能夠輔助脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，改變呼吸鏈，進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激[29]。而CYP4A是一種氧化應(yīng)激的引發(fā)劑，能夠促進(jìn)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，其在肝臟中的表達(dá)上調(diào)也伴隨ROS的產(chǎn)生[30]。體外HepG2細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度的綠原酸(2 mmol/L)通過(guò)抑制CYP2E1和CYP4A的表達(dá)來(lái)改善油酸誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷[31]。綠原酸還能調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。在乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠肝臟急性衰竭模型中，提前口服綠原酸能夠緩解肝臟損傷，主要作用機(jī)制是通過(guò)增加血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和NADPH醌脫氫酶1基因的表達(dá)量，激活細(xì)胞核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)信號(hào)通路，發(fā)揮自身的抗氧化作用[32]。類(lèi)似的，在四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的損傷模型研究中，給小鼠腹腔注射金銀花提取物(主要成分為綠原酸)，同樣發(fā)現(xiàn)能激活Nrf2信號(hào)通路，降低氧化應(yīng)激，緩解肝損傷[33]。此外，還有報(bào)道指出，綠原酸能夠降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-8的分泌及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)[34]。另外，肉雞飼糧中添加1 000 mg/kg綠原酸可提高肉雞的抗熱應(yīng)激能力和雞胸肉的氧化穩(wěn)定性[35]；斷奶仔豬飼糧中添加1 000 mg/kg綠原酸，可顯著提高仔豬血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶以及過(guò)氧化氫酶的活性，并且降低腹瀉率，表明綠原酸具有提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力的作用[36]?？傊G原酸通過(guò)降低ROS水平和激活Nrf2信號(hào)通路降低或阻止氧化應(yīng)激的發(fā)生，達(dá)到抗氧化的效果，其作為飼料添加劑可提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力。

3.2 抗炎

炎癥反應(yīng)是機(jī)體保護(hù)自身的一種免疫反應(yīng)，但炎癥因子的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致組織損傷、器官衰竭，如不能及時(shí)治療甚至?xí)斐伤劳鯷37]。綠原酸具有抗炎作用，可下調(diào)促炎因子的表達(dá)量，提高機(jī)體的抵抗力。總結(jié)綠原酸發(fā)揮抗炎作用的研究顯示：1)綠原酸通過(guò)介導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路發(fā)揮抗炎功能[38]。Zamani-Garmsiri等[39]研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝小鼠飼喂含有綠原酸(0.2 g/kg)的飼糧，12周后，綠原酸抑制了多囊性腎病NF-κB信號(hào)通路中p65蛋白的移位和核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白激酶(nuclear factor-kappa B inhibitor protein kinase,IκB)的磷酸化，顯著降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)以及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等促炎因子的表達(dá)量，從而實(shí)現(xiàn)抗炎癥效果。類(lèi)似報(bào)道證明，綠原酸可以降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞中IL-1β和IL-6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)[40]。2)細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，綠原酸能夠緩解LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥，通過(guò)抑制環(huán)氧合酶-2和NOD樣受體家族蛋白3(NOD-like receptor family protein 3，NLRP3)炎癥小體的蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[38]。3)在緩解糖尿病和腎病的研究中發(fā)現(xiàn)，綠原酸能增加Nrf2的核易位和HO-1的表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[41]；Zhao等[42]利用隱綠原酸對(duì)LPS處理的RAW 264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)隱綠原酸使HO-1基因的表達(dá)量上升，能夠激活Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。4)綠原酸可介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路發(fā)揮抗炎功能[43]。綠原酸能夠緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎性損傷，降低細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)1/2、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、p38激酶、磷酸化p38激酶、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)以及磷酸化c-Jun氨基末端激酶蛋白的表達(dá)，通過(guò)抑制MAPK/ERK/JNK信號(hào)通路，緩解小鼠腸道炎癥[43]。Tan等[44]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸能夠緩解鼠傷寒沙門(mén)氏菌誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥，主要機(jī)制為綠原酸促使腸道中生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth arrest specific 5，GAS5)的表達(dá)，而后長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微小RNA 23a(microRNA 23a，miR-23a)，進(jìn)而上調(diào)第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)的表達(dá)量，降低p38 MAPK通路相關(guān)基因p38和磷酸化p38蛋白的表達(dá)水平，通過(guò)長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5/miR-23a/PTEN軸抑制p38 MAPK信號(hào)通路，從而抑制腸道炎癥。

3.3 抑菌

綠原酸是金銀花、山銀花和杜仲等中草藥的主要抑菌成分[6]。綠原酸對(duì)包括大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、痢疾桿菌、假單胞菌屬及幽門(mén)螺桿菌屬等革蘭氏陰性菌和包括金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、鏈球菌及葡萄球菌屬等革蘭氏陽(yáng)性菌均有明顯的抑制作用[6]。Chai等[45]認(rèn)為綠原酸抑菌作用是由于綠原酸協(xié)同抑制了細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的合成，并抑制了細(xì)菌蛋白和DNA的合成。動(dòng)物試驗(yàn)表明，綠原酸不僅抑制腸道有害細(xì)菌，還可促進(jìn)腸道有益菌的增殖。Gong等[46]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)奶牛乳腺炎，添加綠原酸可提高牛奶中κ-酪蛋白的水平，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對(duì)病原菌的吞噬能力。另外，綠原酸可以增加斷奶仔豬回腸和盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量，提高乙酸鹽和丙酸鹽的含量，還可增加盲腸菌群多樣性，提高盲腸中乳酸菌屬、普氏桿菌屬和厭氧弧菌屬等有益菌屬的豐度，維持仔豬腸道菌群穩(wěn)態(tài)，保護(hù)腸道健康[47-48]。

綠原酸的抗菌機(jī)制可能與以下有關(guān)：1)綠原酸可作用于病原菌的細(xì)胞外膜，促使其凹陷和脫落，并降低細(xì)胞外膜LPS的含量，使細(xì)胞外膜通透性增加，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和ATP的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞外膜破壞、代謝中斷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[49]。Sun等[8]在冷藏雞肉中評(píng)估綠原酸對(duì)沙門(mén)氏菌病原體的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)綠原酸能夠改變沙門(mén)氏菌細(xì)胞外膜的通透性，促進(jìn)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和ATP的釋放，并且抑制蘋(píng)果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性，破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞代謝，引發(fā)細(xì)胞死亡。2)在發(fā)光二極管(LED)光照射下，綠原酸進(jìn)入病菌細(xì)胞膜發(fā)生光氧化，生成過(guò)氧化氫(H2O2)，H2O2在光的作用下分解生成羥基自由基(·OH)，·OH使細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致DNA斷裂、細(xì)胞凋亡[50]。3)綠原酸可作用于細(xì)菌中的酶，發(fā)揮抗菌作用。肺炎鏈球菌神經(jīng)氨酸酶具有去除宿主細(xì)胞表面聚糖末端的唾液酸殘基，促進(jìn)病菌黏附和定殖的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸通過(guò)氫鍵、鹽橋與肺炎鏈球菌神經(jīng)氨酸酶建立較強(qiáng)的結(jié)合，涉及的氨基酸殘基包括Arg347、Ile348、Lys440、Asp372、Asp417以及Glu768，其中與Arg347的側(cè)鏈可形成帽狀結(jié)構(gòu)，將綠原酸鎖定在神經(jīng)氨酸酶的活性位點(diǎn)，并與其發(fā)生結(jié)合，因此綠原酸是一種潛在的肺炎鏈球菌神經(jīng)氨酸酶抑制劑[51]。4)綠原酸可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS耗竭，最終影響細(xì)菌凋亡。ROS是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要分子，細(xì)胞內(nèi)ROS耗竭是細(xì)菌凋亡的核心調(diào)節(jié)因子。研究表明，先在大腸桿菌中添加綠原酸，而后用H2O2進(jìn)行處理，綠原酸能誘導(dǎo)大腸桿菌中ROS耗竭，進(jìn)而影響大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致細(xì)菌凋亡[13]。

3.4 抗病毒

綠原酸具有抗病毒作用，對(duì)流感病毒[52]、呼吸道合胞病毒[53]、皰疹病毒[54]、腸道病毒[55]、H5N1病毒[52]、腺病毒[53]和乙型肝炎病毒[56]均有明顯抑制作用。關(guān)于綠原酸抗病毒的機(jī)理還不是很清楚，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)綠原酸的抗病毒機(jī)制可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)：1)綠原酸可以抑制病毒表面酶的活性。Karar等[52]研究指出，神經(jīng)氨酸酶是流感病毒被膜上的一種糖蛋白，具有抗原性，能催化糖苷水解，協(xié)助成熟的病毒顆粒脫離宿主細(xì)胞并感染新的細(xì)胞，造成流感病毒在體內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)散。綠原酸、酚酸和衍生物對(duì)產(chǎn)氣莢膜桿菌、H5N1和重組H5N1 N端組氨酸標(biāo)簽的神經(jīng)氨基酶有抑制活性的作用。綠原酸通過(guò)與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合，達(dá)到抑制病毒在動(dòng)物體內(nèi)擴(kuò)散的目的。2)綠原酸的抗病毒活性與其自身含有的鄰苯二酚基團(tuán)有關(guān)，Ikeda等[57]研究發(fā)現(xiàn)，可能是由于綠原酸水解出的具有鄰苯二酚基團(tuán)的咖啡酸，而咖啡酸能抑制皰疹病毒的活性，干擾皰疹病毒DNA的復(fù)制，從而發(fā)揮抗病毒的作用。

3.5 抗腫瘤

上世紀(jì)80年代，綠原酸被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤的作用，引起了科研工作者的廣泛興趣。Xue等[58]首次報(bào)道，綠原酸能夠促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞和抑制M2型巨噬細(xì)胞，抑制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，提出作用途徑是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M1/M2極化。也有報(bào)道指出，綠原酸能降低癌細(xì)胞的增殖速率、線粒體ATP的產(chǎn)生以及侵襲能力，作用方式是綠原酸提高癌細(xì)胞分化基因小泛素相關(guān)修飾物1(small ubiquitin-related modifier 1，SUMO1)的表達(dá)，同時(shí)不改變正常細(xì)胞中該基因的表達(dá)量。因此，綠原酸有望成為一種安全有效的癌細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑[59]。此外，有研究認(rèn)為，綠原酸緩解結(jié)腸癌的作用是通過(guò)降低ROS發(fā)揮抑制作用，還可通過(guò)降低細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[60-61]。因此，綠原酸具有抗癌作用，但作用方式不盡相同，其潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，綠原酸具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒及抗癌等多種生物學(xué)功能，其可能的作用機(jī)理如圖3所示。

↑：提高 increased；↓：降低 decreased；CGA：綠原酸 chlorogenic acid；CYP2E1：細(xì)胞色素P450 2E1 cytochrome P450 2E1；CYP4A：細(xì)胞色素P450 4A cytochrome P450 4A；SOD：超氧化物歧化酶 superoxide dismutase；GSH-Px：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 glutathione peroxidase；CAT：過(guò)氧化氫酶 catalase；PKD-NF-κB：多囊性腎病核轉(zhuǎn)錄因子-κB nuclear factor kappa B in polycystic kidney disease；IL-8：白細(xì)胞介素-8 interleukin-8；LPS：脂多糖 lipopolysaccharide；SUMO1：小泛素相關(guān)修飾物1 small ubiquitin-related modifier 1；NLRP3：NOD樣受體家族蛋白3 NOD-like receptor family protein 3；NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子-κB nuclear factor kappa B；HO-1：血紅素加氧酶-1 heme oxygenase-1；p-IκB：磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白激酶 phosphorylated nuclear factor-kappa B inhibitor protein kinase；ERK：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶 extracellular signal-regulated protein kinase；p-ERK：磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶 phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase；p38:p38激酶 p38 kinase；p-p38：磷酸化p38激酶 phosphorylated p38 kinase；JNK：c-Jun氨基末端激酶 c-Jun N-terminal kinase；p-JNK：磷酸化c-Jun氨基末端激酶 phosphorylated c-Jun N-terminal kinase；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶 mitogen-activated protein kinase。

4 綠原酸在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1 家畜

規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)中，由于早期斷奶、病原菌侵襲等，仔豬發(fā)生斷奶應(yīng)激和腸道穩(wěn)態(tài)失衡，造成腸炎和腹瀉[62]。王宇等[63]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼糧添加1 000 mg/kg的綠原酸顯著降低斷奶仔豬的料重比，認(rèn)為其可能的機(jī)制是綠原酸提高了仔豬十二指腸黏膜中蔗糖酶活性和回腸黏膜中鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(sodium-glucose co-transporter 1，SGLT1)mRNA的表達(dá)量，而SGLT1是位于小腸黏膜上皮細(xì)胞和腎單位近曲小管的一種跨膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，可以促進(jìn)葡萄糖的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。Zhang等[64]在斷奶仔豬的飼糧中添加1 000 mg/kg綠原酸，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組仔豬十二指腸的絨毛高度和絨隱比顯著提高，結(jié)腸食糜乳酸菌的豐度提高，大腸桿菌的豐度顯著降低，說(shuō)明綠原酸可以保護(hù)豬的腸道健康。另外，綠原酸還可降低斷奶仔豬十二指腸和空腸中丙二醛的含量，緩解腸道氧化損傷，改善腸道屏障功能[62]。因此綠原酸具有調(diào)節(jié)仔豬腸道菌群，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸能夠改善母豬卵母細(xì)胞成熟、發(fā)育及受精能力。與對(duì)照組相比，體外補(bǔ)充綠原酸可以顯著促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷，同時(shí)提高胚泡形成的速率，改善豬胚胎體外發(fā)育能力[65]。另有報(bào)道指出，添加50 μmol/L綠原酸與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)44 h后再進(jìn)行體外受精，通過(guò)電穿孔技術(shù)檢測(cè)受精卵的發(fā)育和質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)綠原酸顯著提高胚泡的生長(zhǎng)速率，降低細(xì)胞凋亡指數(shù)，改善胚胎發(fā)育[66]。綠原酸還可提高冷凍公豬精子的質(zhì)量，補(bǔ)充100 μmol/L綠原酸，公豬精子存活率提高了8%～10%，質(zhì)膜完整性提高了4%～6%[67]，可替代維生素E作為豬精液的保護(hù)劑[68]。以上研究說(shuō)明，綠原酸對(duì)母豬卵母細(xì)胞和公豬精子發(fā)育均有積極影響，可作為卵母細(xì)胞發(fā)育成熟和精子的保護(hù)劑，但綠原酸是否作用于抗氧化相關(guān)信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)母豬卵母細(xì)胞成熟和緩解公豬精液的氧化應(yīng)激，目前仍不清楚，具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

綠原酸在反芻動(dòng)物上的研究，主要關(guān)注其抗氧化性能和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的影響。Bongartz等[69]探究了堿處理對(duì)葵花粕中綠原酸和蛋白質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)堿處理增加了過(guò)瘤胃蛋白的含量，與對(duì)照組相比，堿處理組奶牛腸道蛋白質(zhì)消化率提高了10%，原因在于經(jīng)堿處理生成的綠原酸醌和葵花粕中的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，降低了瘤胃微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解，增加了過(guò)瘤胃蛋白的含量。除了直接應(yīng)用于反芻動(dòng)物飼糧，因其抗氧化性能，綠原酸還在牛奶乳制品中表現(xiàn)出積極的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在乳桿菌發(fā)酵乳中加入綠原酸，牛奶的抗氧化活性增加，這是由于綠原酸被乳桿菌發(fā)酵代謝生成3，4-二羥基肉桂酸，同時(shí)乳桿菌的蛋白水解活性增加了生物活性肽的釋放量，以達(dá)到抗氧化的作用[70]。另外，Liu等[7]在育肥羊飼糧中添加綠原酸，發(fā)現(xiàn)顯著提高了羊血清中超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力，顯著降低了血清中皮質(zhì)醇含量。盡管綠原酸的抗氧化功能被一再證實(shí)，但由于反芻動(dòng)物特有的消化器官，還需要著重研究綠原酸對(duì)反芻動(dòng)物胃腸道健康、胃腸道菌群的調(diào)控機(jī)理以及作為乳制品添加劑的應(yīng)用價(jià)值。

4.2 家禽

綠原酸對(duì)家禽影響的研究，主要關(guān)注改善生長(zhǎng)性能、減緩熱應(yīng)激以及緩解炎癥等。Zhao等[35]在白羽肉雞飼糧中添加1 000 mg/kg的綠原酸，肉雞的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率顯著優(yōu)于對(duì)照組，且添加綠原酸顯著提高了雞肉中多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比值；不僅如此，在熱應(yīng)激條件下，飼糧添加綠原酸還顯著提高了雞胸肉的氧化穩(wěn)定性和脂肪酸含量。綠原酸緩解熱應(yīng)激的研究，可能的機(jī)制是綠原酸通過(guò)增加低氧誘導(dǎo)因子-1的活性，促進(jìn)熱休克轉(zhuǎn)錄因子-1基因表達(dá)，增強(qiáng)自噬，提升機(jī)體抗熱應(yīng)激的能力[71]，而提高雞胸肉的氧化穩(wěn)定性可能主要源于綠原酸的抗氧化性。此外，綠原酸還能夠緩解雛雞受損的軟骨，促使其恢復(fù)和再生。Cheng等[72]使用靜脈注射甲苯噻嗪(5 mg/kg)的方法建立雛雞的關(guān)節(jié)軟骨損傷模型，發(fā)現(xiàn)飼喂綠原酸可上調(diào)Y染色體性別決定區(qū)-盒轉(zhuǎn)錄因子9(sex-determining region Y-box transcription factor 9，SOX9)和Ⅱ型膠原α1鏈(collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1)這2個(gè)基因的表達(dá)。而SOX9是軟骨生成所需的轉(zhuǎn)錄激活因子，COL2A1是SOX9的1個(gè)下游基因，二者上調(diào)可以促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)[72]。另外，綠原酸抑制損傷部位血管異常生成和纖維化，下調(diào)炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α、磷酸化p65以及金屬蛋白酶基因的表達(dá)，可能的作用機(jī)制是綠原酸通過(guò)作用于Nrf2信號(hào)通路緩解氧化應(yīng)激，恢復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨[72]。在水禽的研究中，給1日齡北京鴨接種鴨乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus，DHBV)陽(yáng)性血清，建立鴨乙肝病毒感染模型，7～17日齡每天口服100 mg/kg的綠原酸，發(fā)現(xiàn)口服綠原酸降低了鴨血清中DHBV的水平，抑制了病毒DNA的復(fù)制[73]，說(shuō)明綠原酸具有抗DHBV的作用，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外，關(guān)于綠原酸改善家禽生產(chǎn)性能的作用機(jī)制，是否通過(guò)作用于腸道微生物區(qū)系提高腸道優(yōu)勢(shì)菌群豐度以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，還有待研究。

5 小 結(jié)

近年來(lái)，因其具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗癌、提高繁殖性能以及保護(hù)畜禽腸道健康等特性，綠原酸的研究呈上升趨勢(shì)，成為天然植物提取物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。我國(guó)綠原酸的植物來(lái)源廣泛、產(chǎn)量高，作為飼料添加劑，在畜禽生產(chǎn)中具有極大的前景。未來(lái)對(duì)綠原酸的研究應(yīng)集中在以下方面展開(kāi)：1)綠原酸的作用機(jī)制有待研究。目前綠原酸的作用機(jī)理尚不完全清楚，后續(xù)的研究需關(guān)注綠原酸的作用靶點(diǎn)，探索綠原酸作用的分子機(jī)制及其酯水解產(chǎn)物，甚至不同代謝產(chǎn)物對(duì)腸道健康的影響及其機(jī)制。2)綠原酸的利用方式有待研究。由于綠原酸口服效果不佳，如何提高畜禽對(duì)綠原酸的利用效率，也是后續(xù)研究的重點(diǎn)之一。3)作為飼料添加劑，綠原酸在畜禽生產(chǎn)中的適宜劑量還有待確定。綜上可知，系統(tǒng)研究綠原酸的代謝過(guò)程和生物學(xué)功能，揭示其作用的分子機(jī)制及其高效利用方式，對(duì)未來(lái)綠原酸成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中的新型飼料添加劑至關(guān)重要。