趙天行，陳福生，陳 濤，吳仁蔚*，陳世貴

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院湖北省傳統(tǒng)發(fā)酵食品國際科技合作基地，湖北 武漢 430070；2.湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜都 443000）

溫州蜜柑（Citrus unshiu）作為湖北省主栽的一種鮮食水果，營養(yǎng)豐富，具有獨(dú)特的風(fēng)味，蜜柑中含有類胡蘿卜素、維生素、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]。由于蜜柑成熟季節(jié)相對(duì)集中，鮮果貯藏期短，容易腐爛，導(dǎo)致柑農(nóng)賣果難。同時(shí)果品形狀、大小等品質(zhì)不同，占產(chǎn)量20%～30%的非標(biāo)果也降低了果農(nóng)的收入?；诿鄹痰募庸ぬ攸c(diǎn)開發(fā)高附加值的加工產(chǎn)品是促進(jìn)柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的有效途徑。以蜜柑作為釀造調(diào)味品和飲料的主要或補(bǔ)充原料，可充分利用蜜柑資源，增加農(nóng)民的收入，而且蜜柑中的功能成分、芳香成分，賦予產(chǎn)品特殊的營養(yǎng)和風(fēng)味[2]，可以滿足人們更高層次的需求。

食醋是以糧食、水果、酒類等含淀粉、糖類、酒精等物質(zhì)為原料發(fā)酵而成的一種酸性調(diào)味品。在數(shù)千年的生產(chǎn)過程中，世界各地形成了各具特色的生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品。中國的四大名醋（山西陳醋、鎮(zhèn)江香醋、福建紅曲醋、四川麩曲醋）和日本的黑醋，是以高粱、稻谷、小麥等谷物為原料釀造的。意大利的香醋、西班牙的雪莉醋和美國的蘋果醋等是以葡萄、蘋果等水果為原料釀造的[3]。按照醋酸發(fā)酵方式，可分為固態(tài)發(fā)酵醋和液態(tài)發(fā)酵醋。固態(tài)醋酸發(fā)酵是中國的獨(dú)特工藝，其產(chǎn)品具有色澤醬紅、風(fēng)味濃郁、口感醇厚、酸味柔和等優(yōu)點(diǎn)[4]。液態(tài)深層發(fā)酵食醋具有生產(chǎn)占地面積小、自動(dòng)化程度高、勞動(dòng)強(qiáng)度低、產(chǎn)酸快等優(yōu)點(diǎn)，越來越被國內(nèi)食醋生產(chǎn)廠家所采用[5]。然而，液態(tài)發(fā)酵食醋的風(fēng)味單一、酸味刺激性強(qiáng)，且色澤寡淡，不符合我國消費(fèi)者的消費(fèi)習(xí)慣[6]。所以目前我國液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的食醋主要用作原料，通過與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵食醋混合調(diào)配，或者添加食品增香劑和著色劑等方式來生產(chǎn)低端的食醋產(chǎn)品[7]。因此提高液態(tài)發(fā)酵食醋的風(fēng)味和色澤是我國液態(tài)發(fā)酵食醋迫切需要解決的問題。

醋酸菌（acetic acid bacteria，AAB）是革蘭氏陰性的專性好氧細(xì)菌，可將糖（主要是單糖和雙糖）、糖醇或其他醇類氧化為相應(yīng)的有機(jī)酸、醛或酮等物質(zhì)，是食醋釀造的關(guān)鍵微生物[8]。醋酸菌可產(chǎn)生多種有益的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如葡萄糖酸、二羥基丙酮、維生素C、果聚糖等。陳亨業(yè)等[9]分離到一株產(chǎn)棕色素，并且風(fēng)味優(yōu)良的醋酸菌—葡糖桿菌（Gluconobactersp.）FBFS 82菌株，并將其應(yīng)用于食醋釀造。

本研究以葡糖桿菌FBFS 82發(fā)酵柑橘果汁，生產(chǎn)色素發(fā)酵液，與液態(tài)發(fā)酵的原醋進(jìn)行調(diào)配，制作色澤和風(fēng)味優(yōu)良、營養(yǎng)豐富的釀造型蜜柑醋。并對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性、營養(yǎng)特性進(jìn)行分析，以期改善液態(tài)發(fā)酵食醋存在的色澤寡淡、酸味刺激性強(qiáng)等缺陷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡糖桿菌（Gluconobactersp.）FBFS 82：由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存[9]。

柑桔和液態(tài)發(fā)酵的原醋：由湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司提供。

5種液態(tài)發(fā)酵食醋：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；GC-2010-DSQ Ⅱ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美國Agilent 公司；BLBio-10SL液態(tài)發(fā)酵罐：上海百侖生物科技有限公司；Hitachi L-8900氨基酸測(cè)定儀：日本日立公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 色素發(fā)酵液的制備

柑桔去皮、榨汁，接種10%（V/V）已活化的FBFS 82菌液，于無菌的10 L發(fā)酵罐28 ℃發(fā)酵6 d，對(duì)色素發(fā)酵液的總酸、總糖和游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定。色素發(fā)酵液經(jīng)多層紗布過濾，于密閉容器中，室溫儲(chǔ)存。

1.3.2 蜜柑醋的配制

將液態(tài)發(fā)酵的原醋、色素發(fā)酵液和無菌水進(jìn)行調(diào)配，制備蜜柑醋，使其酸度為5 g/100 mL，色素發(fā)酵液體積分?jǐn)?shù)分別為10%、15%、20%和25%（以蜜柑醋A、B、C和D表示）。蜜柑醋以封口的透明玻璃瓶盛裝，于自然條件下儲(chǔ)存。

1.3.3 測(cè)定方法

總酸測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[10]的方法；總糖測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[11]的方法。

蜜柑醋的感官特性：參考GB/T 18187—2000《釀造食醋》對(duì)蜜柑醋的感官特性進(jìn)行評(píng)價(jià)[12]。

色澤穩(wěn)定性：蜜柑醋在自然條件下儲(chǔ)存至60 d，每10 d取樣一次，檢測(cè)其色素在波長440 nm處的吸光度值（OD440nm值）[13]，評(píng)價(jià)色素的穩(wěn)定性。

游離氨基酸的測(cè)定：參考GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測(cè)定》[14]，對(duì)色素發(fā)酵液、液態(tài)發(fā)酵的原醋，以A和C為代表的蜜柑醋進(jìn)行游離氨基酸的測(cè)定。

揮發(fā)性成分分析：參考楊馥秀等[15]的方法，并略作改動(dòng)，采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（headspace solidphasemicroextraction-gaschromatography-massspectrometry，HS-SPME-GC-MS）分析蜜柑醋中的揮發(fā)性成分。

HS-SPME參數(shù)條件：取8mL稀釋后的蜜柑醋，加入20mL頂空瓶，并加入3.0 g氯化鈉，于60 ℃以200 r/min磁力攪拌，平衡15 min。將已活化的萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭，吸附40 min。

GC-MS參數(shù)及分析條件：GC進(jìn)樣口250 ℃，采用不分流進(jìn)樣，5 min后吹掃流量20 mL/min；載氣為高純氦氣，柱流量為1 mL/min；毛細(xì)管色譜柱為Agilent HP-5ms（30 m×250 μm×0.25 μm）；離子源溫度230 ℃，單四極桿溫度150 ℃，離子傳輸管溫度280 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～600 m/z，全掃描模式。優(yōu)化后的程序升溫條件為：初始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 速率升至120 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升至140 ℃后再以10 ℃/min 升至250 ℃，保持1 min。后運(yùn)行條件為250 ℃，5 min。

將測(cè)得物質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫NIST 8（national institute of standards and technology）中進(jìn)行對(duì)比分析，以匹配度大于80確證所檢出的各種化學(xué)成分。

采用環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)物，各化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比計(jì)算各化合物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素發(fā)酵液的理化指標(biāo)分析

對(duì)FBFS 82發(fā)酵柑橘汁的色素發(fā)酵液的理化指標(biāo)進(jìn)行分析，總糖含量為7%，總酸含量為1.23 g/100 mL，pH值為2.45，游離氨基酸含量為3693.43 mg/100 mL，其中γ-氨基丁酸含量為1 769.90 mg/100 mL。

2.2 蜜柑醋的感官特性

由圖1可知，液態(tài)發(fā)酵的原醋為淡黃色，滋味寡淡，有明顯的醋酸的刺激性氣味。蜜柑醋A為琥珀色，隨著色素發(fā)酵液含量的增加，顏色逐步加深，蜜柑醋D為紅棕色。與市售的5款液態(tài)發(fā)酵食醋相比，蜜柑醋的色澤有光鮮感，更誘人。同時(shí)蜜柑醋的滋味和氣味更豐富。蜜柑醋B、C、D均具有明顯的醬香味，酸味柔和，所有蜜柑醋均無異味。結(jié)果表明隨著色素發(fā)酵液含量的增加，感官特性明顯得到改善。

圖1 蜜柑醋與幾種市售食醋色澤的比較Fig.1 Comparison of color between citrus vinegar and several commercial vinegar products

2.3 蜜柑醋的色澤穩(wěn)定性

由圖2可知，在自然條件下儲(chǔ)存，蜜柑醋A、B、C和D的OD440nm值均沒有明顯變化，說明葡糖桿菌FBFS 82的色素穩(wěn)定，光照、低酸對(duì)其色澤無影響。而且蜜柑醋體態(tài)透明澄清，僅蜜柑醋D有少量懸浮的顆粒?？赡苁且?yàn)樯匕l(fā)酵液未經(jīng)過過濾、澄清等處理。

圖2 蜜柑醋的色澤穩(wěn)定性評(píng)價(jià)Fig.2 Evaluation of color stability of citrus vinegar

2.4 蜜柑醋的氨基酸種類與含量

對(duì)液態(tài)發(fā)酵的原醋，以蜜柑醋A和C為代表進(jìn)行氨基酸含量測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 蜜柑醋游離氨基酸的種類與含量Table 1 Types and contents of free amino acid in citrus vinegar

續(xù)表

由表1可知，液態(tài)發(fā)酵的原醋中檢測(cè)到12種游離氨基酸（包括7種必需氨基酸），氨基酸總含量為（47.26±6.18）mg/100g。蜜柑醋A和C均含有18種游離氨基酸，組成蛋白質(zhì)的氨基酸為17種，含量分別為（892.46±19.1）mg/100 g和（1 811.90±22.72）mg/100 g，其中包含人體必需的8種氨基酸。李婷等[16]對(duì)我國四大名醋進(jìn)行分析，氨基酸含量分別為山西老陳醋（227.32～331.15）mg/100 mL、保寧醋（188.27～208.29）mg/100 mL、鎮(zhèn)江香醋（127.58～141.44）mg/100 mL，永春老醋（82.95～96.33）mg/100 mL。白燁[17]以巴氏醋桿菌單獨(dú)發(fā)酵，以及巴氏醋桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵柑橘汁制備果醋，其游離氨基酸均為17種，含量分別為314.43 mg/100 g和322.92 mg/100 g。孫曉昕等[18]對(duì)市售的27種果醋進(jìn)行測(cè)定，僅4種檢測(cè)到低含量的游離氨基酸。上述結(jié)果表明，蜜柑醋在營養(yǎng)成分——游離氨基酸方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，而且蜜柑醋A和C（以氨基酸態(tài)氮計(jì)）分別達(dá)到了鎮(zhèn)江香醋的一級(jí)產(chǎn)品和特級(jí)產(chǎn)品的水平[19]。

此外，在蜜柑醋A和C中分別檢測(cè)到（182.27±8.68）mg/100 mL，（383.19±8.27）mg/100 mL的功能成分γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸的含量與色素發(fā)酵液的含量呈正比，而液態(tài)發(fā)酵的原醋中未檢測(cè)到該組分，說明γ-氨基丁酸來自色素發(fā)酵液。

根據(jù)游離氨基酸風(fēng)味強(qiáng)度，將對(duì)風(fēng)味有貢獻(xiàn)的氨基酸分為鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸[20]。在檢測(cè)的蜜柑醋A和C中，甜味氨基酸占比為（與組成蛋白質(zhì)的氨基酸之比）均為65%；鮮味氨基酸占比分別為的15%和16%；苦味氨基酸的占比分別為18.45%和17.29%。說明蜜柑醋中呈味氨基酸多樣化，其滋味豐富。

上述結(jié)果充分說明色素發(fā)酵液營養(yǎng)豐富，在氨基酸的種類和含量方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，特別是富含功能成分γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中具有營養(yǎng)作用，是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，同時(shí)也是強(qiáng)神經(jīng)抑制性氨基酸，具有鎮(zhèn)靜、降血壓、降低血氨、提高腦活力、促進(jìn)乙醇代謝、參與組織再生等多種生理作用[21-23]。本研究制作的釀造型蜜柑醋不僅可以用于飲料和調(diào)味料的二次開發(fā)，在進(jìn)一步拓展保健醫(yī)藥作用方面具有良好的前景。

2.5 蜜柑醋揮發(fā)性成分測(cè)定

以蜜柑醋A和C為代表，采用HS-SPME-GC-MS對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，經(jīng)NIST8譜庫檢索識(shí)別，鑒定出的揮發(fā)性成分及其含量見表2。

表2 蜜柑醋A和C的揮發(fā)性成分及含量Table 2 Volatile components and contents in citrus vinegar A and C

續(xù)表

蜜柑醋A檢測(cè)到51種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酸類6種、酯類13種、醇類4種、醛類7種、酮類6種、酚類3種和其他物質(zhì)12種。蜜柑醋C檢測(cè)到60種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酸類7種、酯類18種、醇類4種、醛類9種、酮類5種、酚類5種和其他物質(zhì)12種。隨著色素發(fā)酵液含量的增加，揮發(fā)性香氣物質(zhì)的種類，說明色素發(fā)酵液提供了更多的香氣成分。

酸味是食醋最基礎(chǔ)的味道，酸類也是影響食醋風(fēng)味和品質(zhì)的一類化合物[24]。蜜柑醋A和C中，共有的酸味物質(zhì)主要有醋酸、（-）-乙酰基-l-酒石酸、辛酸等。醋酸是刺激氣味強(qiáng)烈的酸，是食醋經(jīng)典的氣味；而辛酸具有奶酪味及少許的澀味。根據(jù)其他學(xué)者對(duì)永春香醋和永春老醋[25]、水塔陳醋[15]等的分析，辛酸與食醋香氣有較高的相關(guān)性[26]。酯類化合物在香味的組成中占有特別重要的地位，大多具有花香、果香、酒香或蜜香香氣，是評(píng)價(jià)食醋產(chǎn)品的一個(gè)主要指標(biāo)。蜜柑醋A和C中酯類物質(zhì)的種類和含量在所有揮發(fā)性成分中占比最高，特別是乙酸乙酯，乙酸乙酯是引起果醋的發(fā)酵風(fēng)味的物質(zhì)之一[27]。此外，蜜柑醋中還含有豐富的醇酚類、醛酮類和雜環(huán)類等化合物，如乙偶姻、苯乙醇、壬醛、糠醛等，這些化合物共同賦予了蜜柑醋獨(dú)特的香味與營養(yǎng)[28-29]。其中乙偶姻作為一種食用級(jí)的香料，應(yīng)用廣泛[30]；苯乙醇具有獨(dú)特風(fēng)味，如玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等[31]；壬醛等醛類物質(zhì)具有良好的風(fēng)味特征，具有玫瑰花香[32]。

3 結(jié)論

本研究以葡糖桿菌FBFS82的色素發(fā)酵液與液態(tài)發(fā)酵的原醋調(diào)配制備蜜柑醋，結(jié)果表明，調(diào)配后能顯著改善產(chǎn)品的感官特性和營養(yǎng)特性。其中，含10%（V/V）色素發(fā)酵液的蜜柑醋A，色澤濃郁，優(yōu)于市售的5款液態(tài)發(fā)酵食醋；蜜柑醋A和C的游離氨基酸含量，達(dá)到（892.46±19.1）mg/100 g和（1 811.90±22.72）mg/100 g，特別是其富含具有生理活性的成分——γ-氨基丁酸（（182.27±8.68）mg/100 mL和（383.19±8.27）mg/100 mL）；蜜柑醋A和C分別含有51種和60種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酸類、酯類、醇類、醛類、酮類、酚類和其他物質(zhì)，其中賦予香氣的酯類成分含量最高。本研究制作的蜜柑醋是色、香、味和營養(yǎng)俱佳的釀造型果醋。