趙珺怡，楊 波，羅瑞明,*，張赫宇，蘇春霞，胡倩倩，趙曉策

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

冷鮮灘羊肉是生鮮灘羊肉的一種重要產(chǎn)品，在常規(guī)0～4 ℃冷藏過(guò)程中，冷鮮灘羊肉會(huì)被外源性腐敗微生物[1-2]污染，從而導(dǎo)致肉的腐敗變質(zhì)，甚至爆發(fā)食源性疾病乃至食物中毒[3]。有研究表明，微生物的生長(zhǎng)繁殖不僅取決于貯藏環(huán)境中氧氣含量、溫度高低，也與生長(zhǎng)基質(zhì)的pH值有關(guān)[4]。不同屠宰、分割工序[5]與不同包裝形式[6]所含有的微生物有一定的差異。目前，針對(duì)冷鮮肉微生物的研究熱點(diǎn)多集中于采用選擇性培養(yǎng)基、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、酶聯(lián)免疫法等分析冷鮮肉的生物多樣性，通過(guò)致腐微生物生長(zhǎng)值與模型參數(shù)擬合，結(jié)合肉品質(zhì)感官指標(biāo)與理化指標(biāo)，建立貨架期預(yù)測(cè)模型等[7-11]。但對(duì)于冷鮮肉微生物與微環(huán)境之間的分子生態(tài)關(guān)系與群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)演替的分子機(jī)制卻鮮有報(bào)道。

隨著后基因組時(shí)代的來(lái)臨，組學(xué)技術(shù)在食品微生物領(lǐng)域也得到廣泛關(guān)注。Dugat-Bony等[12]應(yīng)用宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了由9 種微生物組成的奶酪表皮在4 周成熟期中的變化。通過(guò)對(duì)其轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量的分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝與脂肪代謝途徑是最顯著的代謝途徑，相關(guān)差異基因源于假絲地霉酵母、干酪棒桿菌和蜂房哈夫尼亞菌。Jeong等[13]運(yùn)用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了韓國(guó)泡菜發(fā)酵水中的微生物群落演替，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵泡菜水中初期微生物群落中含有明串珠菌、乳酸菌、假單胞菌屬和泛菌屬，而發(fā)酵第3天直至發(fā)酵結(jié)束明串珠菌占主導(dǎo)地位。在冷鮮肉微生物領(lǐng)域，張赫宇等[14]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同冷藏階段灘羊肉微生物的16S rRNA基因V3區(qū)進(jìn)行測(cè)序，研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌、腸桿菌、熱死環(huán)絲菌和乳酸菌為冷藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，而優(yōu)勢(shì)真菌主要為酵母菌。張鐵華等[15]研究了冷鮮牛肉微生物菌相變化，結(jié)果表明在低溫貯藏過(guò)程中，G－小桿菌系是導(dǎo)致無(wú)包裝鮮牛肉腐敗變質(zhì)的主要表面菌系，而G+球菌系是導(dǎo)致真空包裝鮮牛肉腐敗變質(zhì)的主要菌系。

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)興起于宏基因組之后，以微生物群落的總RNA為研究對(duì)象[16]，探索特定時(shí)期下群體全部基因組轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄規(guī)律。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能從轉(zhuǎn)錄水平研究復(fù)雜微生物群落變化，能更好的挖掘潛在的新基因和差異表達(dá)基因功能，探究各微生物成員對(duì)整體環(huán)境的貢獻(xiàn)以及微生物功能與功能之間相互影響調(diào)控的作用機(jī)制。

本研究以冷鮮灘羊肉表面微生物為研究對(duì)象，采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)0、4、8 d微生物基因組差異轉(zhuǎn)錄、代謝途徑與3 個(gè)貯藏時(shí)期微生物群落演替的關(guān)系進(jìn)行探究，通過(guò)比較3 個(gè)貯藏時(shí)期的變化推測(cè)微生物優(yōu)勢(shì)菌優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的原因，為冷鮮肉保鮮分子生態(tài)學(xué)理論構(gòu)建打下基礎(chǔ)，為冷鮮灘羊肉的貯藏加工提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊后腿肉（當(dāng)天屠宰），取自寧夏鹽池縣大夏牧場(chǎng)食品有限公司（灘羊飼養(yǎng)期間不做任何生物性防疫工作，且定期進(jìn)行清糞、消毒處理），托盤密封包裝。

TRIzol試劑盒 美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；GeneReadTM試劑盒 德國(guó)Qiagen公司；三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTPs）、fragmentation buffer、核糖核酸酶H、DNA聚合酶I 美國(guó)TaKaRa Bio公司；AMPure XP純化磁珠 英國(guó)Beckman Coultier公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1G超凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)公司；Sorvall Legend Micro 17常溫離心機(jī)、Forma 994 -80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司；HiSeq高通量測(cè)序儀 中國(guó)Novogene公司；Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng) 中國(guó)天能公司；vortex-genie2 G-560E旋渦混合儀 美國(guó)SI公司；Qubit 2.0熒光計(jì) 上海Life Technologies公司；ScanSpeed MiniVac Alpha冷凍離心機(jī) 美國(guó)Scan Speed公司；GeneAmp PCR system 9700普通PCR儀 美國(guó)Life公司；Implen GmbH納米光度計(jì) 德國(guó)Schatzbogen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選用寧夏鹽池縣大夏牧區(qū)的灘羊作為實(shí)驗(yàn)材料，在0～4 ℃條件下貯藏的冷鮮灘羊肉上采集樣品。采集樣品前，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液對(duì)冷凍收集管、鑷子、刀等取樣器進(jìn)行消毒，干燥后密封于無(wú)菌密封袋。用消毒刀分別在貯藏時(shí)間為0、4 d和8 d共9 個(gè)灘羊腿（每個(gè)貯藏時(shí)間段取3 個(gè)羊腿）上進(jìn)行刮擦，得到刮屑。采集的樣本包括肌肉、結(jié)締組織、血液和脂肪等。

在第0天時(shí)，快速刮取3 個(gè)羊腿上的同一位置獲得3 個(gè)平行性樣本（≥150 mg），分別放入3 個(gè)冷凍管并標(biāo)記為C0_1、C0_2和C0_3；然后將其表面刮擦物含菌落、血液、肉汁液等放置在-80 ℃的液氮中冷凍1 h。冷鮮貯藏4 d的3 個(gè)羊腿與0 d取樣相同位置以同樣方式獲得樣本，分別標(biāo)記為C4_1、C4_2、C4_3；冷鮮貯藏8 d的3 個(gè)羊腿也以同樣的方式取樣分別標(biāo)記為C8_1、C8_2和C8_3。將所有樣品放入冰箱（0～4 ℃）中冷藏。每組樣本分別進(jìn)行3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 RNA的提取

將上述樣本封裝于滅菌容器，在無(wú)菌條件玻璃球振蕩分散，制備蒸餾水懸浮液，質(zhì)量濃度1 g/100 mL。取1.0×109（1 mL菌液OD600nm為1～1.5）的細(xì)菌培養(yǎng)物放入2 mL離心管中，室溫12 000×g離心30 s，除去上清液。使用TRIzol試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明分別提取樣本的總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解情況（圖1）。確保RNA的純度和濃度符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，即RNA完整值（RNA integrity number，RIN）大于等于8.0。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳的總RNA質(zhì)量分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis for quality analysis of total bacterial RNA

1.3.3 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及Illumina HiSeq測(cè)序

使用評(píng)估污染物試劑盒對(duì)1.3.2節(jié)所得RNA進(jìn)行評(píng)估，確定樣品未發(fā)生污染后，使用GeneReadTM試劑盒除去rRNA。并加入碎片緩沖液使mRNA分解成小片段。

使用隨機(jī)六聚體引物以上述mRNA為模板合成單鏈cDNA，使用TaKaRa試劑盒以單鏈cDNA為模板合成雙鏈cDNA。使用AMPure XP純化磁珠純化雙鏈cDNA后，加入A尾，修復(fù)末端。通過(guò)PCR擴(kuò)增修飾的雙鏈cDNA，用AMPure XP磁珠濃縮回收PCR產(chǎn)物，構(gòu)建基因文庫(kù)。

使用Qubit2.0熒光計(jì)初步定量每個(gè)文庫(kù)。將每個(gè)文庫(kù)質(zhì)量濃度稀釋至2 ng/μL。使用Q-PCR方法確定文庫(kù)的有效濃度（確定為＞2 nmol/L）。

使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)檢測(cè)并確定DNA插入物的大小是否符合預(yù)期。在Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)存在一定比例低質(zhì)量數(shù)據(jù)，為了保證后續(xù)分析的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，首先對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，獲取用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。預(yù)處理方法參見(jiàn)方法。處理步驟如下：1）去除質(zhì)量值≤5的堿基數(shù)達(dá)到一定比例的reads（默認(rèn)reads長(zhǎng)度的40%，設(shè)置為40）；2）去除含N的堿基數(shù)目達(dá)到一定比例的reads（默認(rèn)reads長(zhǎng)度的10%，設(shè)置為10）；3）去除Adapter污染（默認(rèn)Adapter序列與reads序列有15 bp的overlap，設(shè)置為15）；4）在有宿主污染可能性的前提下，需與宿主數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，過(guò)濾掉可能是宿主污染的reads（默認(rèn)設(shè)置比對(duì)一致性大于等于90%的reads為宿主污染）。

1.3.5 De novo組裝

針對(duì)每個(gè)樣品經(jīng)預(yù)處理得到的clean reads，先使用NCBI的rRNA、tRNA以及SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分離出來(lái)宏基因組中rRNA序列，剩下的mRNA序列則使用拼接軟件Trinity（version: r20140413p1）分別進(jìn)行從頭組裝，然后對(duì)所有樣品的序列整合并使用CD-HIT-EST去冗余（設(shè)定序列一致性閾值為0.95），得到unigene集合。

1.3.6 生物信息學(xué)分析

將得到的unigene集合進(jìn)行一系列差異表達(dá)基因分析：差異基因的基因本體（gene ontology，GO）注釋、差異基因京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注釋、GO顯著性富集分析及KEGG顯著性富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

表1 數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計(jì)Table 1 Preprocessing results of metatranscriptomic data

限定序列質(zhì)量后，共獲得有效數(shù)據(jù)57.02 GB。由表1可知，每個(gè)樣品的Q30堿基的占比不小于91.48%，此結(jié)果表明序列數(shù)據(jù)可靠，可用于下一步分析。此外，整個(gè)基因組的GC含量（鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的比例）在48.9%到55.15%之間，這表明在基因組測(cè)序過(guò)程中，覆蓋的整個(gè)區(qū)域沒(méi)有偏差，保證了后續(xù)拼接和注釋的可靠性。

2.2 De novo組裝結(jié)果

單基因長(zhǎng)度區(qū)間分布在301～500 bp之間，單基因總數(shù)達(dá)77 709 個(gè)，占所有單基因長(zhǎng)度區(qū)間的60.25%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示，4 746 個(gè)單基因長(zhǎng)度大于2 000 bp，占所有單基因長(zhǎng)度區(qū)間的0.04%，平均長(zhǎng)度643 bp，連續(xù)N50長(zhǎng)度為672 bp。164 836 個(gè)轉(zhuǎn)錄序列來(lái)自序列重疊組，平均長(zhǎng)度733 bp，連續(xù)N50長(zhǎng)度為871 bp。單基因長(zhǎng)度主要分布在300～2 000 bp之間，占所有單基因長(zhǎng)度區(qū)間的99.94%，8 829 個(gè)基因長(zhǎng)度大于2 000 bp，占所有單基因長(zhǎng)度區(qū)間的0.06%?？傊瑔位驍?shù)目豐富，轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度分布合理，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。

圖2 單基因序列和轉(zhuǎn)錄序列長(zhǎng)度分布圖Fig.2 Unigene and transcript length distribution

2.3 物種注釋結(jié)果

通過(guò)與Nr（NCBI non-redundant protein sequences）庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)（e-value≤10-5），由于每一條序列可能會(huì)有多個(gè)比對(duì)結(jié)果，得到多個(gè)不同的分類級(jí)別，為了保證其生物意義，采取LCA算法（應(yīng)用MEGAN軟件的系統(tǒng)分類）[17]，將出現(xiàn)第一個(gè)分支前的分類級(jí)別，作為該序列的物種注釋信息。從門、屬和種水平上的相對(duì)豐度表出發(fā)，選取出在各樣品中的最大相對(duì)豐度排名前10的門類，并將其余的物種設(shè)置為其他，繪制出各樣品對(duì)應(yīng)的物種注釋結(jié)果在其水平的統(tǒng)計(jì)圖，如圖3所示。

圖3 物種注釋在門（a）、屬（b）和種（c）水平的結(jié)果Fig.3 Results of species annotation at the levels of phylum (a),genus (b) and species (c)

根據(jù)所有樣品在各水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35 名的屬及其在每個(gè)樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從分類信息和樣品間差異兩個(gè)層面進(jìn)行聚類，找出研究樣品中聚集較多的物種或樣品，結(jié)果展示見(jiàn)圖4。

由圖3與圖4所知，Proteus hauseri（變形桿菌）、Macrococcus caseolyticus（巨大球菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌）、Aspergillus flavus（黃曲霉）、Terrabacter（腫大地桿菌屬）、Aeromonas hydrophila（嗜水氣單胞菌）在C4_1樣品中富集，C4_3樣品中的優(yōu)勢(shì)菌株是Trichodesmium erythraeum（紅色毛癬菌）。C8_1樣品中的優(yōu)勢(shì)菌是Lactococcus lactis（乳酸菌），而在C8_2樣品中占主導(dǎo)地位是Gammaproteobacteria bacterium（伽馬蛋白細(xì)菌）和L. lactis。在4 d的樣品中發(fā)現(xiàn)了3 組在不同樣品中具有相似豐度變化的生物，第1組是P. hauseri和M. caseolyticus；第2組是A. flavus；第3組是Terrabactersp.28和A. hydrophila（嗜水氣單胞菌）。由此可以看出，貯藏至第8天時(shí)，冷鮮灘灘羊肉的主要優(yōu)勢(shì)微生物為變形菌門、乳酸菌屬等。其中，變形菌門中的假單胞菌和腸桿菌是造成冷鮮肉腐敗變質(zhì)的主要微生物，這與已有研究結(jié)果一致[18-19]。

灘羊肉冷藏第8天的優(yōu)勢(shì)菌株為G. bacterium（變形菌）和L. lactis（乳酸菌）。在灘羊肉冷藏初期，革蘭氏陰性細(xì)菌如P. hauseri、N. spumigena、M. caseolyticus、G. prolifera、A. flavus、A. phagocytophilum、Terrabactersp. 28、A. hydrophila、G. bacterium占據(jù)主導(dǎo)地位。

圖4 物種豐度聚類圖在門（a）、屬（b）和種（c）水平的結(jié)果Fig.4 Clustering maps showing species abundance at the levels of phylum (a), genus (b) and species (c)

假單胞菌是好氧微生物，生長(zhǎng)幾乎不受其他微生物影響[20]。在灘羊肉的冷藏過(guò)程中，假單胞菌優(yōu)先利用貯藏環(huán)境中的氧氣，當(dāng)氧氣消耗殆盡時(shí)，灘羊肉成熟過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄糖成為其生長(zhǎng)所需的能量來(lái)源[21]。假單胞菌在繁殖和新陳代謝的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有特殊氣味的硫化物，酯、酸和其他變質(zhì)代謝產(chǎn)物[22]會(huì)導(dǎo)致灘羊肉的腐敗變質(zhì)。與假單胞菌相比，腸桿菌的增長(zhǎng)速度較緩慢。腸桿菌為兼性厭氧菌，可以發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。在冷藏環(huán)境下，灘羊肉中的葡萄糖與中間代謝產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖作為碳源被腸桿菌利用，產(chǎn)生胺類代謝物質(zhì)導(dǎo)致肉的腐敗[23-24]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，灘羊肉細(xì)胞逐漸衰老死亡，可提供的能量和氧氣逐漸變少，革蘭氏陽(yáng)性菌特別是乳酸菌（L. lactis）逐漸成為優(yōu)勢(shì)微生物。乳酸菌分泌一種名為nisin的抗菌肽，該物質(zhì)能與脂II分子結(jié)合在革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上形成孔洞，致其細(xì)胞死亡[25]，從而確保自己的優(yōu)勢(shì)地位。

2.4 差異基因的篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)0～4、4～8、0～8 d的冷鮮灘羊肉中微生物群落的基因表達(dá)情況檢測(cè)，采用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq[26]進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)顯著性（signature，S）以q-value小于0.005和|log2（fold change）|大于1為篩選條件判斷基因是否為差異基因[27]，TRUE：為差異基因，F(xiàn)ALSE意為不是差異基因。將篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因用火山圖展示。橫坐標(biāo)代表基因在不同實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)倍數(shù)的變化；縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著程度，q-value越小，-lg（q-value）越大，則差異越顯著，結(jié)果如圖5所示。

圖5 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.5 Volcano plots of differentially expressed genes

篩選結(jié)果顯示，從貯藏時(shí)間為4 d與0 d、8 d與4 d、8 d與0 d的冷鮮灘羊肉中測(cè)得的差異表達(dá)基因數(shù)分別為429、15、1 529 個(gè)。在C4與C0中，上調(diào)基因?yàn)?47 個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?82 個(gè)；在C8與C4中，上調(diào)基因?yàn)? 個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?3 個(gè)；在C8與C0中，上調(diào)基因?yàn)?27 個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?02 個(gè)。上調(diào)基因分別占基因總數(shù)的42.42%、13.33%和47.54%。下調(diào)基因分別占基因總數(shù)的57.58%、86.67%和52.46%。

2.5 差異基因的GO富集分析

圖6 差異基因GO顯著富集圖Fig.6 Significantly enriched GO terms of differentially expressed genes

采用非中央超幾何分布的GOseq[28]方法將P＜0.05作為閾值篩選GO條目，如圖6所示，具體地顯示了擁有較多基因富集的GO富集分析的條目。其中，在C0與C4對(duì)比組內(nèi)的60 個(gè)分子功能、74 個(gè)生物過(guò)程和27 個(gè)細(xì)胞組成分別于329、838、277 個(gè)unigenes有關(guān)；在C4與C8對(duì)比組內(nèi)8 個(gè)分子功能、35 個(gè)生物過(guò)程和17 個(gè)細(xì)胞組成分別與10、55、18 個(gè)unigenes有關(guān)；在C0與C8對(duì)比組內(nèi)的70 個(gè)分子功能、121 個(gè)生物過(guò)程和57 個(gè)細(xì)胞組成分別與981、1 811、2 860 個(gè)unigenes相關(guān)。除去細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異基因，C0與C4對(duì)比組，富集差異基因較多的分子功能是受體、蛋白質(zhì)、GTP和核苷酸的結(jié)合，肽酶的活性以及結(jié)構(gòu)分子的活性；富集差異基因較多的生物過(guò)程有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)聚合與水解和光合作用等；C4與C8對(duì)比組，富集差異基因較多的生物過(guò)程有離子轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)；C0與C8對(duì)比組中，富集差異基因較多的分子功能是不同氨基酸酶的活性，富集差異基因較多的生物過(guò)程主要是核苷酸代謝、蛋白質(zhì)水解與組裝、蛋白質(zhì)代謝、磷酸化作用和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等。

2.6 差異表達(dá)基因的EggNOG/COG注釋

通過(guò)EggNOG分析將25 類unigenes簇進(jìn)行分類，如圖7所示。其中包含最多基因的功能基因簇分別為R—一般功能預(yù)測(cè)（8 150 個(gè)匹配基因）、S—功能未知（7 900 個(gè)基因）和T—信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（6 000 個(gè)基因）。此外，同源基因簇內(nèi)的基因具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，被認(rèn)為來(lái)自同一祖先。而E—氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、F—核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、G—碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、H—輔酶運(yùn)輸和代謝與I—脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝也占有一定份額，這與GO富集分析得到的結(jié)果較為一致。

圖7 差異基因單基因EggNOG 注釋結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖Fig.7 EggNOG annotation results of differentially expressed unigenes

2.7 差異基因的KEGG富集分析

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過(guò)Pathway顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)[29]。將生物代謝通路劃分為6 類，分別為：細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝、生物體系統(tǒng)，將3 個(gè)不同貯藏時(shí)期的微生物所富集的差異基因進(jìn)行KEGG注釋，如圖8所示。

由圖8可知，富集基因較多的代謝通路有核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝、碳水化合物代謝以及氨基酸代謝等。作為微生物的基礎(chǔ)代謝，微生物普遍存在的核苷酸水解酶對(duì)核苷酸代謝分解具有促進(jìn)作用。核苷酸水解酶先將核苷酸水解，生成核苷，再通過(guò)酶的催化作用下生成堿基和磷酸核糖[30]，磷酸核糖參與磷酸戊糖途徑生成6-磷酸果糖并且參與糖酵解，最終產(chǎn)物丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)途徑進(jìn)行反應(yīng)，將能量代謝與物質(zhì)代謝聯(lián)系在一起，增加了微生物可利用的碳源，增強(qiáng)了微生物的增殖能力。

圖8 不同貯藏時(shí)期差異基因表達(dá)的KEGG Pathway富集結(jié)果Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes at different chilled storage period

氨基酸代謝在微生物演替中的作用主要包括2 個(gè)方面，一方面主要用于合成自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)、多肽和其他含氮物質(zhì)，以產(chǎn)生相應(yīng)的氮源為微生物利用；另一方面可通過(guò)脫氨、轉(zhuǎn)氨、聯(lián)合脫氨的方式分解為α-酮酸、胺類及二氧化碳[31]。其中，α-酮酸可通過(guò)胺化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為糖、脂質(zhì)或非必需氨基酸，也可參與三羧酸循環(huán)完全氧化成二氧化碳和水，并釋放出大量能量[32]。乳酸菌以游離氨基酸作為底物，通過(guò)氨基酸的脫羧反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的堿性生物胺，維持自身的生長(zhǎng)繁殖[33]。且氨基酸代謝產(chǎn)生的大量二氧化碳會(huì)降低貯藏環(huán)境的氧氣濃度，正好滿足了兼性厭氧的乳酸菌的生長(zhǎng)條件，使得乳酸菌成為冷鮮灘羊肉貯藏期內(nèi)的優(yōu)勢(shì)微生物之一。

能量代謝屬于新陳代謝的一種，碳水化合物代謝也是能量代謝的過(guò)程。碳水化合物代謝過(guò)程中會(huì)形成磷酸鹽化合物，在連接磷酸鹽基團(tuán)和其他分子的化學(xué)鍵中存儲(chǔ)大量能量[34]。隨著能量代謝與碳水化合物代謝的顯著富集表明冷鮮灘羊肉表面微生物的代謝活躍，貯藏后期的微生物種類和數(shù)量相比于原始菌相產(chǎn)生了較大的增長(zhǎng)，與能量代謝有關(guān)的差異基因表達(dá)富集較為顯著。經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的冷鮮貯藏，灘羊肉表面微生物也呈現(xiàn)出一定的差異，但是就總體3 個(gè)貯藏時(shí)間段而言，因?yàn)樵季啻嬖诘幕A(chǔ)使微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性更大，差異性則相對(duì)較小，而差異性主要是由于冷鮮肉微生物的生長(zhǎng)代謝導(dǎo)致的。

在0～4 ℃的貯藏條件下，微生物的生命活動(dòng)顯著降低，一些嗜冷菌可以正常增殖，假單胞菌和腸桿菌都可以在這個(gè)溫度條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。宰前活體灘羊肉的pH值為中性，但在宰后成熟階段，灘羊肉肌肉組織中的糖原在糖酵解酶作用下生成乳酸。同時(shí)，呼吸作用并沒(méi)有停止，產(chǎn)生了大量能量和磷酸，在乳酸和磷酸的共同作用下，灘羊肉的pH值下降，造成胴體僵硬。此時(shí)鈣激活酶作用于僵硬的胴體使其自溶，pH值降低至5.6～6.0[35]，這種酸性環(huán)境最適合乳酸菌的生長(zhǎng)。在貯藏過(guò)程中，冷鮮灘羊肉中的脂肪成分被附著在表面的優(yōu)勢(shì)微生物脂肪酶催化水解成脂肪酸和甘油[36]，由甘油氧化形成的三碳醇酸是絲氨酸降解的中間產(chǎn)物，經(jīng)磷酸化后生成3-磷酸甘油酯，可進(jìn)一步參與糖異生或糖酵解反應(yīng)。1-磷酸葡萄糖是糖異生途徑產(chǎn)物，在儲(chǔ)藏前期，假單胞菌和腸桿菌先利用氧氣進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，在貯藏后期時(shí)，假單胞菌和腸桿菌則利用之前反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖為底物繼續(xù)繁殖生長(zhǎng)，成為主要優(yōu)勢(shì)微生物。而在貯藏中期豐度較高的不動(dòng)桿菌屬為專性需氧菌，在氧氣含量較少的貯藏后期大幅減少；微小桿菌屬和放線菌屬為非嗜冷菌，在低溫貯藏環(huán)境下的生長(zhǎng)繁殖相對(duì)收到抑制，且乳酸菌在生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生的乳酸也會(huì)抑制這些微生物的生長(zhǎng)繁殖，使它們隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸變?yōu)榱觿?shì)微生物。

3 結(jié) 論

為系統(tǒng)揭示冷鮮肉微生物群落的變化，本研究利用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)0、4、8 d三個(gè)冷鮮貯藏時(shí)間段灘羊肉表面微生物群落的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，共獲得57.02 GB的轉(zhuǎn)錄本有效數(shù)據(jù)。研究表明在3 個(gè)貯藏時(shí)期中，C4與C0組的上調(diào)基因?yàn)?47 個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?82 個(gè)；C8與C4組的上調(diào)基因?yàn)? 個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?3 個(gè)；而在C8與C0組中，上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為727 個(gè)和802 個(gè)。這些差異表達(dá)基因主要富集在核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝、碳水化合物代謝以及氨基酸代謝等代謝途徑。通過(guò)利用這些代謝途徑所產(chǎn)生的代謝物和能量作為微生物生長(zhǎng)繁殖的底物，假單胞菌和腸桿菌成為貯藏期間冷鮮灘羊肉表面的優(yōu)勢(shì)微生物。在貯藏后期，由于貯藏環(huán)境中殘存的少量氧氣與灘羊肉較低的pH值，乳酸菌豐度漲幅較大，也成為優(yōu)勢(shì)微生物之一。本研究對(duì)貯藏過(guò)程中的冷鮮灘羊肉微生物進(jìn)行分析，可為冷鮮灘羊肉貯藏期間微生物及肉品質(zhì)量預(yù)報(bào)、控制技術(shù)研發(fā)提供理論參考。