付偉超，梁昊岳，于文穎，王浩雨，劉二濤，高瀛岱*

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300020；2.天津市血液病基因治療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300020）

0 引言

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）是一種通過流式細(xì)胞儀對(duì)單個(gè)細(xì)胞或顆粒進(jìn)行多參數(shù)分析、分選的技術(shù)，在血液學(xué)、免疫學(xué)和干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要作用[1-2]。光路系統(tǒng)是常規(guī)流式細(xì)胞儀的核心部件，決定著儀器檢測能力的高低，其主要由激光器和濾光片等元件組成，分別用于激發(fā)和接收相應(yīng)的光信號(hào)[1-5]。光路系統(tǒng)中，激光器種類和數(shù)量較為固定，需根據(jù)儀器型號(hào)由廠家進(jìn)行升級(jí)，但光路收集系統(tǒng)不是固定的，各種型號(hào)的濾光片可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行調(diào)配和更換。BD AriaⅢ流式細(xì)胞儀采用空間激發(fā)模式，光路收集系統(tǒng)采用八角形和三角形接收裝置，每個(gè)激光器都有單獨(dú)的接收裝置。光信號(hào)被各種型號(hào)的濾光片分割，同時(shí)被相應(yīng)的光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）（作為熒光通道）接收，以達(dá)到熒光檢測的目的[1-3，6-7]。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是細(xì)胞內(nèi)正常代謝產(chǎn)生的含氧化合物，主要由線粒體產(chǎn)生。在正常生理?xiàng)l件下，ROS的產(chǎn)生和消除是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，在細(xì)胞信號(hào)介導(dǎo)、細(xì)胞周期和基因表達(dá)等過程中發(fā)揮著重要作用[8-9]。同時(shí)，高濃度ROS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞中的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞衰老和凋亡[8-9]。造血干祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）廣泛存在于哺乳動(dòng)物骨髓、臍帶血和外周血中，在機(jī)體正常造血調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮著十分重要的作用[10-13]。在正常生理?xiàng)l件下，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測HSPC中的ROS水平，可用于判斷細(xì)胞分裂及分化的潛能[8]。

隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，研究人員需要探索的細(xì)胞標(biāo)記物逐漸增多，多色流式細(xì)胞術(shù)為實(shí)驗(yàn)室提供了重要技術(shù)支撐[11-13]。在多色流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，研究人員需在已有抗體的基礎(chǔ)上，結(jié)合流式細(xì)胞儀具體配置，合理進(jìn)行配色方案設(shè)計(jì)，達(dá)到降低研究成本和使效益最大化的目的[6，14]。特別是在非常規(guī)染色流式實(shí)驗(yàn)中，新染料的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜與常規(guī)染料有較大重疊，影響實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)，甚至出現(xiàn)常規(guī)光路收集系統(tǒng)無法接收相應(yīng)發(fā)射光的問題，因此研究人員亟須探索合理優(yōu)化檢測方案的可行性方法。本研究通過對(duì)小鼠骨髓中的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）、造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）和多能祖細(xì)胞（multipotent progenitor cell，MPP）的ROS水平進(jìn)行流式分析，驗(yàn)證切換濾光片對(duì)實(shí)現(xiàn)多色流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的有效性，旨在為多色流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)人員改進(jìn)工作方法、優(yōu)化多色流式細(xì)胞術(shù)檢測方案、擴(kuò)大多激光流式細(xì)胞儀的檢測能力提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 主要材料

6~8周B6小鼠，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所SPF級(jí)動(dòng)物房；熒光彩虹微球，購自美國碧迪公司；Lineage磁珠、LS分選柱，購自德國美天旎公司；APC-Cy7標(biāo)記的抗小鼠Lineage抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠c-Kit抗體、PE-Cy7標(biāo)記的抗小鼠Sca-1抗體、BV421標(biāo)記的抗小鼠CD150抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD48抗體，所有單克隆抗體均購自美國eBioscience公司；MitoSOX Red染色液，購自中國翊圣生物科技有限公司；7-AAD染色劑，購自美國碧迪公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），購自無錫傲銳東源生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

BD AriaⅢ流式細(xì)胞儀，購自美國Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備

斷頸處死B6小鼠后取骨髓細(xì)胞，離心棄上清液，加入適量Lineage磁珠，4℃避光15 min后用PBS清洗，重懸過Lineage陰選柱子，富集Lineage陰性細(xì)胞。將Lineage陰性細(xì)胞分組，設(shè)置熒光減一（fluorescence minus one，F(xiàn)MO）對(duì)照管（標(biāo)記所有抗體，不標(biāo)記MitoSOX Red染色液）作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)樣本管（標(biāo)記所有抗體和MitoSOX Red染色液）作為實(shí)驗(yàn)組，每管Lineage陰性細(xì)胞量約為1×106。對(duì)照組使用流式抗小鼠Lineage、c-Kit、Sca-1、CD48、CD150抗體染色，避光30 min后用PBS清洗后重懸備用。將MitoSOX Red染色液按說明書稀釋成工作液，實(shí)驗(yàn)組每管加入500μL工作液，混勻，37℃避光孵育20 min后用PBS清洗重懸。上機(jī)前所有管中加入7-AAD染色劑去除死細(xì)胞。

1.3.2 流式細(xì)胞儀的調(diào)節(jié)與質(zhì)控

將561 nm激光器對(duì)應(yīng)的556LP、582/15濾光片（PE通道）與488 nm激光器對(duì)應(yīng)的655LP、695/40濾光片（PerCP-Cy5.5通道）對(duì)調(diào)，此時(shí)PerCP-Cy5.5通道用于接收488 nm激光器激發(fā)、波長范圍在574.5~589.5 nm的發(fā)射光（MitoSOX Red染色液發(fā)射光）。使用熒光彩虹微球檢測各熒光通道信號(hào)。重復(fù)執(zhí)行變更濾光片操作3次，分別記錄PerCP-Cy5.5通道熒光強(qiáng)度中位值（median of fluorescence intensity，MFI）和相對(duì)變異系數(shù)%rCV。

1.3.3 樣本檢測

將所有樣本管加入2μL 7-AAD染色劑，2 min后上機(jī)檢測。調(diào)節(jié)前向角散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）信號(hào)、側(cè)向角散射光（side scatter，SSC）信號(hào)和各熒光通道電壓，使得各通道細(xì)胞群處于合適位置。按照“橫平豎直”原則，調(diào)節(jié)各熒光通道的補(bǔ)償數(shù)值。分別記錄對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的流式結(jié)果，記錄結(jié)果時(shí)各PMT的電壓和熒光通道的補(bǔ)償數(shù)值應(yīng)保持一致。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用BD AriaⅢ流式細(xì)胞儀配置的Diva 8.0.1軟件和專業(yè)流式數(shù)據(jù)分析軟件FlowJo 10.6.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用IBM SPSS Statistics 20.0軟件和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制圖形，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀濾光片變更結(jié)果

濾光片變更前后各熒光通道接收熒光波長范圍的變化詳見表1。濾光片變更直接影響PerCP-Cy5.5通道和PE通道捕獲的發(fā)射光波長范圍。MitoSOX Red染色液最大激發(fā)波長為510 nm，最大發(fā)射波長為580 nm，故使用488 nm激光器激發(fā)。儀器原配置沒有適合此染色液的熒光接收通道，更換濾光片后可用PerCP-Cy5.5通道接收MitoSOX Red染色液的熒光信號(hào)。

表1 濾光片變更前后各熒光通道接收熒光波長范圍的變化

2.2 流式細(xì)胞儀質(zhì)控結(jié)果

圖1為濾光片變更之前流式細(xì)胞儀的質(zhì)控結(jié)果，各熒光通道單參數(shù)直方圖均為單峰，峰圖清晰，說明各通道接收熒光信號(hào)正常。各熒光通道熒光質(zhì)控結(jié)果顯示，所有通道%rCV均在6%以下，處于合理數(shù)值，表明儀器處于正常狀態(tài)，分析結(jié)果可靠。圖2為濾光片變更之后流式細(xì)胞儀的質(zhì)控結(jié)果，F(xiàn)SC、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7、APC、DAPI、PE-Cy7、FITC、7-AAD 8個(gè)通道的熒光信號(hào)值與濾光片變更之前相比，熒光信號(hào)強(qiáng)度無明顯差異，表明濾光片變更后對(duì)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中細(xì)胞表面標(biāo)記物熒光染料的檢測無影響。圖3（a）為濾光片變更前PerCP-Cy5.5通道的直方圖，其接收的熒光值范圍為675~715 nm。圖3（b）為濾光片變更之后PerCP-Cy5.5通道的直方圖，其接收的熒光值范圍變更為575~590 nm?？梢钥闯鰹V光片變更后峰圖位置發(fā)生明顯右移，熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)。熒光參數(shù)結(jié)果顯示本通道%rCV與變更濾光片前相比無明顯變化，如圖4（a）所示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，通過變更濾光片，PerCP-Cy5.5通道MFI增強(qiáng)（P<0.001），如圖4（b）所示。上述結(jié)果表明儀器符合使用標(biāo)準(zhǔn)，變更濾光片后的PerCP-Cy5.5通道可正常接收相應(yīng)熒光信號(hào)，并且接收效果有所提升，分析結(jié)果可靠。

2.3 對(duì)照組小鼠骨髓細(xì)胞中HSC、MPP、HPC分群實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照組中標(biāo)記的各種抗原對(duì)小鼠骨髓中的各類干/祖細(xì)胞分型。小鼠全骨髓細(xì)胞Lineage陰選富集后進(jìn)行抗體標(biāo)記，利用鑒定細(xì)胞死活的7-AAD染色劑和抗小鼠Lineage、c-Kit、Sca-1、CD48、CD150抗體染色后上機(jī)進(jìn)行流式分析。圖5（a）中用FSC和SSC圈出細(xì)胞群，去除碎片，獲得Lineage富集細(xì)胞。圖5（b）中用SSC-W和SSC-H雙參數(shù)去除粘連體，獲得單個(gè)細(xì)胞。圖5（c）為7-AAD染色劑染色結(jié)果。使用7-AAD染色劑染色，利用其非滲透性（不能透過活細(xì)胞細(xì)胞膜的特性）去除死細(xì)胞。圖5（d）中利用細(xì)胞表面抗原信息，在活細(xì)胞中圈出Lineage陰性細(xì)胞，比例約為86.8%，說明磁珠富集純度相對(duì)較高。圖5（e）為c-Kit和Sca-1雙參數(shù)流式分析結(jié)果，在Lineage陰性細(xì)胞中用c-Kit和Sca-1表達(dá)的流式圖圈出Linc-Kit+Sca-1+細(xì)胞（簡稱“LSK細(xì)胞”），比例為2.31%。圖5（f）中利用CD48和CD150的表達(dá)對(duì)LSK細(xì)胞進(jìn)行分型[15-18]。其中，HSC的表型為LSKCD48-CD150+，在LSK細(xì)胞中占比10.1%；偏髓系分化的HPC的表型為LSKCD48+CD150+，命名為HPC1，在LSK細(xì)胞中占比2.69%；偏淋系分化的HPC的表型為LSKCD48+CD150-，命名為HPC2，在LSK細(xì)胞中占比56.9%；MPP的表型為LSKCD48-CD150-，在LSK細(xì)胞中占比16.9%。

圖1 濾光片變更前各熒光通道流式細(xì)胞儀質(zhì)控結(jié)果

圖2 濾光片變更后各熒光通道流式細(xì)胞儀質(zhì)控結(jié)果

2.4 實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓細(xì)胞中HSC、MPP、HPC1和HPC2的ROS水平結(jié)果

通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中各細(xì)胞群PerCPCy5.5通道的熒光強(qiáng)度高低反映小鼠骨髓細(xì)胞中HSC、HPC1、HPC2和MPP的ROS水平。向小鼠骨髓細(xì)胞中加入抗小鼠Lineage、c-Kit、Sca-1、CD48、CD150抗體染色后，再使用MitoSOX Red染色液染色后上機(jī)分析。實(shí)驗(yàn)組中HSC、HPC1、HPC2和MPP圈門方法和對(duì)照組一致，與未加入MitoSOX染色液的樣本（對(duì)照組）相比，4個(gè)細(xì)胞亞群在PerCP-Cy5.5通道的MFI（ROS水平）均增大。圖6中4個(gè)直方圖顯示，和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組PerCP-Cy5.5通道的熒光信號(hào)（ROS水平）整體右移，表明各細(xì)胞亞群均成功標(biāo)記上MitoSOX Red染色液，并實(shí)現(xiàn)了多參數(shù)流式分析。

3 討論

近年來，隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，目前市場上流式細(xì)胞產(chǎn)品配置的激光器種類和數(shù)目不斷增多，儀器自動(dòng)化程度也在逐漸提高，儀器配置可以基本滿足常規(guī)流式檢測需求。與此同時(shí)，熒光素技術(shù)也在快速發(fā)展，很多更亮、性能更穩(wěn)定的熒光染料不斷問世[19-20]。市場上的多數(shù)熒光素的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長存在差異，在多色流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，如果光路系統(tǒng)完全固定，則每個(gè)熒光通道檢測的波長范圍就會(huì)固定，可能會(huì)導(dǎo)致僅可使用有限的幾種熒光素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)搭配，不利于多色流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)與應(yīng)用。通過變更濾光片來合理優(yōu)化儀器的光路配置，可以大大改善熒光素使用的局限性。研究人員在使用新型熒光染料時(shí)，必須優(yōu)先確定好流式細(xì)胞儀的硬件配置、激光器和接收PMT是否可以實(shí)現(xiàn)完全匹配。

圖3 濾光片變更前后PerCP-Cy5.5通道熒光信號(hào)對(duì)比圖

圖4 濾光片變更前后PerCP-Cy5.5通道質(zhì)控情況

圖5 小鼠骨髓HSPC各亞群流式結(jié)果

圖6 小鼠骨髓細(xì)胞中HSC、HPC1、HPC2和MPP的ROS水平結(jié)果

國內(nèi)大多數(shù)高?；蚩蒲性核牧魇狡脚_(tái)均配備自動(dòng)化儀器，學(xué)者們對(duì)流式細(xì)胞儀最佳分選性能條件優(yōu)化進(jìn)行了探索，提出了包括噴嘴大小、鞘液壓力和加電類型等一系列條件的技術(shù)參考[20-21]。針對(duì)流式細(xì)胞儀分析性能的相關(guān)研究報(bào)道較少，利用手動(dòng)切換光路系統(tǒng)的情況不多，制約了一些用于細(xì)胞功能檢測等熒光染料的使用范圍，甚至?xí)绊懸恍╆P(guān)鍵抗原信息的標(biāo)記與識(shí)別[1]。通過靈活運(yùn)用流式細(xì)胞儀相關(guān)硬件配置的技術(shù)方法，可有效改善儀器應(yīng)用范圍，為實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計(jì)多色流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方案提供更廣闊的思路。本實(shí)驗(yàn)所用的流式熒光素耦聯(lián)抗體搭配方案見表2，總體實(shí)驗(yàn)方案涵蓋7種染料。因?yàn)锽D AriaⅢ流式細(xì)胞儀采用空間激發(fā)模式，有4個(gè)獨(dú)立光斑用于接收發(fā)射熒光，故使用配置4種激光器（405、488、561、633 nm）的儀器可以將各種熒光素進(jìn)行最大程度的激發(fā)，有效鑒定出弱表達(dá)群體。使用561 nm激光器，可使PE-Cy7獲得更強(qiáng)的激發(fā)效果，有利于鑒別Sca-1陽性群體。多色流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中因4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料具有和其他熒光素相比熒光溢漏較少的優(yōu)勢，常用于死/活細(xì)胞的鑒定。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，7-AAD染色劑使用561 nm激光器激發(fā)，可有效降低與其他通道的熒光補(bǔ)償數(shù)值，同時(shí)能空出較亮熒光素BV421通道，用于CD150的標(biāo)記。

表2 多色流式實(shí)驗(yàn)抗體染料搭配方案

在配置561 nm激光器的流式細(xì)胞儀中，488 nm激光器的光路收集系統(tǒng)采用三角形接收裝置，分別接收SSC、FITC和PerCP-Cy5.5通道的熒光信號(hào)，并未配置波長范圍在580 nm左右的相關(guān)濾光片。本實(shí)驗(yàn)方案中沒有使用PerCP-Cy5.5的PMT，可將此PMT用作接收MitoSOX Red染色液的接收通道，同時(shí)，所選熒光素中沒有用到PE熒光素，PE通道作為561 nm激光八角形接收裝置中最后一個(gè)PMT檢測器，撤掉其相關(guān)濾光片（556LP和582/15）并不會(huì)影響其余通道熒光信號(hào)的接收。這種情況下，可以將556LP長通濾光片和582/15帶通濾光片轉(zhuǎn)換至PerCP-Cy5.5通道對(duì)應(yīng)的PMT之前，實(shí)現(xiàn)對(duì)MitoSOX Red染色液發(fā)射熒光的接收，從而完成本實(shí)驗(yàn)中所有標(biāo)記物的檢測。

4 結(jié)語

通過流式細(xì)胞儀光路收集系統(tǒng)相關(guān)濾光片的變更，靈活搭配PMT前的濾光片型號(hào)，無需其他光路校準(zhǔn)操作，可有效改變PMT檢測器接收的熒光波長范圍，大幅度增加流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍。隨著多色流式細(xì)胞術(shù)和熒光素耦聯(lián)抗體技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀管理者和使用者需要更加精準(zhǔn)地掌握儀器運(yùn)行的相關(guān)原理，靈活利用其相關(guān)配置。這些方法有助于研究者更好地進(jìn)行抗體組合，優(yōu)化多色流式細(xì)胞術(shù)檢測方案，擴(kuò)展儀器應(yīng)用范圍，對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展和科研成本的降低具有積極的影響。

流式細(xì)胞儀作為一種高靈敏度、強(qiáng)分辨力的細(xì)胞生物學(xué)研究工具，已成為免疫學(xué)和干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域必不可缺的技術(shù)手段之一。未來在流式細(xì)胞儀光路系統(tǒng)的不斷優(yōu)化下，科研人員可更加方便地優(yōu)化多色檢測和抗體組合的設(shè)計(jì)，使多色流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍更加廣泛和深入，為多細(xì)胞亞群鑒定、HSC純化和細(xì)胞生理功能檢測等方面提供更多的思路，使其在科學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。