鄺偉鍵，譚曉宇，何錫然，劉華敏，張 琳，郭家钘，陳素平，霍 楓*

（1.廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院）生物醫(yī)學(xué)部，廣東佛山528311；2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，廣州510010；3.廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司研發(fā)部，廣東佛山528311）

0 引言

肝移植是目前治療終末期肝病的最有效方法。隨著我國(guó)醫(yī)療水平的不斷提升，肝移植手術(shù)成功率大幅度提高。但合格供肝數(shù)量的短缺制約了我國(guó)肝移植事業(yè)的發(fā)展[1]。同時(shí)臨床上有大量的邊緣性供肝因保存或其他原因達(dá)不到移植標(biāo)準(zhǔn)而被廢棄[2]。因此，改善邊緣性供肝質(zhì)量、保持供肝活性是擴(kuò)大供肝源的重要途徑。

肝臟的機(jī)械灌注最早由Starzl等[3]于1968年提出，但受限于當(dāng)時(shí)的機(jī)械設(shè)備性能以及細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便的靜態(tài)冷保存比機(jī)械灌注表現(xiàn)更為優(yōu)越[4]，因此臨床上一直沿用靜態(tài)冷保存長(zhǎng)達(dá)30 a之久。目前由于供肝需求量日益增大，臨床上被迫開始使用更多的邊緣性供肝，此時(shí)機(jī)械灌注再次成為肝臟保存的研究熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明[5-6]，常溫機(jī)械灌注對(duì)供肝的損傷能減少50%，供肝平均保存期增加54%，器官棄用率降低50%。目前國(guó)外已經(jīng)研發(fā)了數(shù)個(gè)常溫灌注設(shè)備并逐漸投入臨床使用[7]，而我國(guó)在相關(guān)領(lǐng)域的研究處于空白狀態(tài)，因此發(fā)展國(guó)內(nèi)的離體肝臟常溫機(jī)械灌注設(shè)備已經(jīng)迫在眉睫。由廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院、南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院以及廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司聯(lián)合研發(fā)的DEVOCEAN-LIVER 2000是國(guó)內(nèi)首創(chuàng)的雙泵雙氧合器的肝臟體外灌注設(shè)備，同時(shí)具備常溫機(jī)械灌注與低溫機(jī)械灌注功能。為驗(yàn)證該設(shè)備常溫機(jī)械灌注的可操作性、安全性以及有效性，本研究采用該設(shè)備對(duì)豬肝臟開展肝臟離體常溫機(jī)械灌注實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其對(duì)肝臟體外保存的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性巴馬小型豬6只，均由東莞松山湖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，體質(zhì)量范圍45~50 kg。手術(shù)前12 h禁食、禁水。

1.2 供肝獲取及修整

首先給實(shí)驗(yàn)豬肌肉注射混合藥物（100 mg舒泰+5 mg咪達(dá)唑侖）進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉后，采用留置針建立耳緣靜脈通路，然后靜脈注射2 mg/（kg·h）丙泊酚維持深度麻醉，隨后進(jìn)行氣管插管及呼吸機(jī)供氧。麻醉穩(wěn)定后，對(duì)實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行腹中線開腹手術(shù)，術(shù)野上至劍突，下至最后一對(duì)乳頭。充分暴露腹腔，游離腹主動(dòng)脈、下腔靜脈及門靜脈。游離完畢后，在耳緣靜脈注射25 000 U肝素。待肝素作用2 min后于下腔靜脈置管，收集血液約1.5 L用于后續(xù)制作灌注液。

血液收集完畢后，打開胸腔，結(jié)扎胸主動(dòng)脈。用1 L 4℃的高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液（HC-A液體，上海輸血技術(shù)有限公司）經(jīng)腹主動(dòng)脈與門靜脈進(jìn)行在體灌注，此時(shí)記錄為熱缺血完畢，開始進(jìn)入冷缺血階段。灌注完畢后，在保留含肝固有動(dòng)脈的腹主動(dòng)脈情況下，快速將肝臟從機(jī)體分離。將供肝置于含生理鹽水的冰盆中進(jìn)行修整，置入動(dòng)脈與門靜脈插管。肝臟熱缺血控制在11 min，冷缺血控制在80 min。

1.3 灌注液制備

手術(shù)收集的實(shí)驗(yàn)豬自體血液過(guò)濾白細(xì)胞后，加入羥乙基淀粉40氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司）擴(kuò)容至2 L，使紅細(xì)胞比容（HCT）維持在28%~35%，并加入10 g白蛋白（美國(guó)杰特貝林生物制品有限公司）、12 500 U肝素（天津生物化學(xué)制藥有限公司）以及1 g頭孢西?。ò不帐∠特S制藥有限公司）后便可作為常溫機(jī)械灌注的灌注液。

1.4 灌注方法

采用DEVOCEAN-LIVER 2000[8]進(jìn)行常溫機(jī)械灌注。具體方法：加入灌注液，排清管路空氣，并等待灌注液充分氧合。隨后將肝臟放置于儲(chǔ)肝器之中，將門靜脈插管和動(dòng)脈插管分別與DEVOCEAN-LIVER 2000連接，此時(shí)記錄為冷缺血完畢，進(jìn)入常溫機(jī)械灌注階段。將計(jì)算機(jī)與壓力傳感器、流量傳感器連接，實(shí)時(shí)記錄灌注液的血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。灌注模式為恒壓模式，灌注溫度為37℃，動(dòng)脈灌注壓維持在60~80 mmHg（1 mmHg=133.32 Pa），門靜脈灌注壓控制在6~8 mmHg，共灌注6 h。

1.5 樣本收集及指標(biāo)檢測(cè)

機(jī)械灌注開始10 min后（記為灌注0 h），使用雅培iSTAT-300G血?dú)夥治鰞x對(duì)每小時(shí)的灌注液進(jìn)行分析，同時(shí)利用微納芯Pointcare V2對(duì)灌注液進(jìn)行生化檢測(cè)。分別取灌注前以及灌注終末時(shí)的肝臟組織用10%福爾馬林固定，進(jìn)行HE染色后在顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)

動(dòng)脈流量及門靜脈流量變化如圖1所示。由圖1可見，灌注液的流量隨著灌注時(shí)間平穩(wěn)增長(zhǎng)。灌注1 h時(shí)動(dòng)脈流量為（0.10±0.06）mL/[min·g（肝重）]，門靜脈流量為（0.61±0.36）mL/[min·g（肝重）]；灌注6 h時(shí)動(dòng)脈流量為（0.19±0.11）mL/[min·g（肝重）]，門靜脈流量為（0.81±0.39）mL/[min·g（肝重）]。灌注1 h與灌注6 h的動(dòng)脈流量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.15），灌注1 h與灌注6 h的門靜脈流量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.32）。動(dòng)脈血液pH值一直維持在7.2~7.5，灌注0 h與灌注6 h的pH值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.263），如圖2所示。

圖1 灌注液流量變化

圖2 動(dòng)脈血液p H值變化

2.2 肝功能

2.2.1 膽汁生成量

肝臟連接灌注設(shè)備以后，不同肝臟產(chǎn)生膽汁的起始時(shí)間不同，但均在前1 h內(nèi)開始形成，隨后每小時(shí)都有膽汁生成，最高峰時(shí)可達(dá)0.008 5 mL/[h·g（肝重）]。但由于缺乏膽鹽，膽汁生成曲線會(huì)呈現(xiàn)倒“V”形，如圖3所示。

2.2.2 轉(zhuǎn)氨酶水平

如圖4、5所示，在灌注初期谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）與谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）均有較大漲幅[ALT達(dá)（48.11±35.05）U/L，AST達(dá)（315.67±275.97）U/L]，隨后的灌注過(guò)程中，ALT、AST雖有漲幅，但整體趨于平穩(wěn)。灌注前ALT為（25.29±9.25）U/L，灌注6 h后為（63.14±43.69）U/L（P=0.05）。灌注前AST為（30.85±9.17）U/L，灌注6 h后為（740.00±281.98）U/L（P=0.00＜0.05）。

圖3 灌注期間膽汁生成量變化

圖4 灌注液ALT變化

圖5 灌注液AST變化

2.2.3 血糖及乳酸濃度

灌注期間血糖變化如圖6所示，灌注前血糖為（16.62±4.97）mmol/L，灌注6 h后為（11.55±3.26）mmol/L（P=0.09），總體呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢(shì)。血液中乳酸的變化如圖7所示，灌注前為（3.23±0.43）mmol/L，灌注6 h后下降至（0.96±0.38）mmol/L，灌注前與灌注6 h的乳酸水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.4 總膽紅素

灌注期間血液中總膽紅素的變化如圖8所示。灌注前總膽紅素為（4.04±0.40）μmol/L，灌注結(jié)束時(shí)為（5.39±4.88）μmol/L。灌注前后膽紅素變化不明顯（P=0.50）。

2.3 組織形態(tài)學(xué)

如圖9所示，肝臟經(jīng)歷一段時(shí)間的缺血后，大部分區(qū)域呈深紅色，顏色并不均一，可見明顯的瘀斑，邊緣無(wú)增厚，表面光滑。經(jīng)DEVOCEAN-LIVER 2000灌注6 h后肝臟外觀如圖10所示，肝臟體積無(wú)增大或縮小，外形無(wú)明顯改變，瘀斑消失，肝門區(qū)域輕微腫脹。肝臟病理切片如圖11所示，灌注前肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)淤血；灌注結(jié)束后小葉結(jié)構(gòu)仍然保持完整，肝竇輕微擴(kuò)張伴有輕微淤血，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞輕微水腫，可見少量灶狀壞死。肝臟灌注前后細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化不明顯。

圖6 灌注液血糖變化

圖7 灌注液乳酸變化

圖8 灌注液總膽紅素變化

圖9 豬肝臟常溫機(jī)械灌注前外觀

圖10 豬肝臟常溫機(jī)械灌注后外觀

3 討論

圖11 豬肝臟常溫機(jī)械灌注前后的HE染色結(jié)果

常溫機(jī)械灌注能為供肝在體外提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣等，使供肝在體外仍然能維持正常的代謝水平。常溫機(jī)械灌注與常規(guī)的靜態(tài)冷保存相比，可延長(zhǎng)保存、修復(fù)損傷的肝臟以及評(píng)價(jià)供肝質(zhì)量[9]。Butler等[10]對(duì)無(wú)缺血的豬肝臟進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)72 h的常溫機(jī)械灌注，灌注結(jié)束時(shí)肝臟依然保持活性，轉(zhuǎn)氨酶仍處于正常水平，光鏡下肝臟小葉以及膽管組織結(jié)構(gòu)完整。Brockmann等[11]利用常溫機(jī)械灌注對(duì)無(wú)缺血的豬肝臟進(jìn)行了20 h的保存，移植后5 d生存率明顯高于同時(shí)長(zhǎng)的冷保存組，同時(shí)發(fā)現(xiàn)灌注保存期的轉(zhuǎn)氨酶水平與生存率具有相關(guān)性。Fondevila等[12]對(duì)熱缺血90 min的豬肝臟進(jìn)行體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）聯(lián)合常溫機(jī)械灌注后進(jìn)行移植，5 d生存率明顯高于冷保存組（100%與0）。

目前，離體肝臟常溫機(jī)械灌注設(shè)備研發(fā)最成熟的分別為英國(guó)牛津大學(xué)的Organ OX metra與荷蘭Organ Assist公司的Liver Assist，兩者都已經(jīng)開展了相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)[13-16]。臨床上的數(shù)據(jù)再結(jié)合大量的動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使常溫機(jī)械灌注后供肝的移植前標(biāo)準(zhǔn)也逐步形成。Ravikumar等[17]使用Organ OX metra對(duì)20人的肝臟（其中4個(gè)為心臟死亡供體，16個(gè)為腦死亡供體）進(jìn)行體外的恒壓常溫灌注并成功移植，移植后6個(gè)月的生存率為100%，作為對(duì)照組的靜態(tài)冷保存法在移植后6個(gè)月生存率則為97.5%，且術(shù)后常溫灌注組的受體AST最高峰遠(yuǎn)低于靜態(tài)冷保存組。上述臨床實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于供肝的評(píng)價(jià)指標(biāo)并不多，灌注過(guò)程中灌注液的pH值維持在7.2~7.4，同時(shí)肝臟平均保持著5 mL/h以上的膽汁生成量（被認(rèn)為反映肝功能的最有價(jià)值指標(biāo)[9]），而門靜脈流量平均保持在0.75~0.85 mL/min，肝動(dòng)脈流量平均保持在0.15~0.3 mL/min。Watson等[18]從2014—2017年使用Liver Asisst對(duì)47個(gè)肝臟進(jìn)行離體灌注，除了膽汁生成量、血液pH值、血液流量以外，還分別對(duì)灌注時(shí)期血液的ALT、乳酸以及血糖進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。其中選擇了ALT＜5 000 U/L、乳酸＜2.5 mmol/L的22個(gè)肝臟進(jìn)行了移植，僅有1例因發(fā)生移植肝原發(fā)性無(wú)功能而死亡。

本研究采用DEVOCEAN-LIVER 2000進(jìn)行常溫機(jī)械灌注。灌注初期，灌注液中的AST與ALT比生理值有較大的漲幅[ALT為（48.11±35.05）U/L，AST為（315.67±275.97）U/L]，這是由于實(shí)驗(yàn)中需要對(duì)動(dòng)物實(shí)施放血以及獲取肝臟后對(duì)血管修補(bǔ)等原因。肝臟共經(jīng)歷了11 min熱缺血與80 min冷缺血，再與DEVOCEAN-LIVER 2000連接恢復(fù)灌注后便形成了缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），IRI能引發(fā)肝臟大量氧自由基的產(chǎn)生，損傷細(xì)胞膜，釋放出胞漿中的轉(zhuǎn)氨酶[19]。但隨后的灌注過(guò)程中，ALT與AST再未出現(xiàn)大幅度增長(zhǎng)，灌注6 h后ALT為（63.14±43.69）U/L、AST為（740.00±281.98）U/L，動(dòng)脈血的pH值維持在7.2~7.5，乳酸保持在（0.96±0.38）mmol/L，證明肝臟在DEVOCEAN-LIVER 2000常溫機(jī)械灌注的保護(hù)下能維持正常的代謝水平，保持活性，并有效抑制IRI的發(fā)生。以上生化與血?dú)庵笜?biāo)均符合Watson等[18]移植前的供肝標(biāo)準(zhǔn)。在灌注后期會(huì)出現(xiàn)膽汁生成量明顯下降的現(xiàn)象，推測(cè)是由于膽汁的重要組分膽鹽缺乏而造成的。膽鹽在體內(nèi)經(jīng)過(guò)腸肝循環(huán)不斷重復(fù)利用生成膽汁[20]，而體外灌注的肝臟因缺少腸肝循環(huán)使膽鹽無(wú)法重新利用，最終導(dǎo)致膽汁生成量減少。Vogel等[21]在灌注液中以140 mg/h的量加入膽鹽，有效解決了膽汁生成量減少的問題。由于國(guó)內(nèi)缺乏無(wú)菌處理的膽鹽，因此本實(shí)驗(yàn)并未加入膽鹽，導(dǎo)致灌注后期的膽汁生成量下降。但即便如此，DEVOCEAN-LIVER 2000灌注的肝臟在后期仍然持續(xù)生成膽汁。由于肝臟經(jīng)歷熱缺血后微循環(huán)堵塞，肝臟表面出現(xiàn)明顯的瘀斑，經(jīng)DEVOCEAN-LIVER 2000灌注6 h后瘀斑消失，灌注流量也逐步提高，證明肝臟內(nèi)血液循環(huán)有所改善。體外常溫機(jī)械灌注除了能直接改善供肝的質(zhì)量以外，還可以為藥物治療、基因干預(yù)等提供一個(gè)良好的科研平臺(tái)[22]。而這些優(yōu)勢(shì)都是使用傳統(tǒng)的靜態(tài)冷保存法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

Organ OX metra采用的是單泵單氧合器的設(shè)計(jì)，該設(shè)備對(duì)血液氧合后由1個(gè)離心泵提供動(dòng)力，分別進(jìn)入動(dòng)脈與門靜脈。其中動(dòng)脈直接進(jìn)入肝臟，而門靜脈到達(dá)設(shè)備頂端的血袋后，再經(jīng)重力作用進(jìn)入肝臟，通過(guò)血袋的壓力閥對(duì)門靜脈灌注壓進(jìn)行調(diào)節(jié)[18]。這種設(shè)計(jì)難以控制門靜脈的流速以及灌注壓[23]，而雙泵雙氧合設(shè)備能對(duì)動(dòng)脈與門靜脈進(jìn)行快速且獨(dú)立的調(diào)節(jié)，也可分開進(jìn)行不同條件的氧合，更接近體內(nèi)肝臟門靜脈與動(dòng)脈的情況。Liver Assist也采用了雙泵雙氧合設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)主要將設(shè)備分為3個(gè)單元，1個(gè)離心泵和1個(gè)氧合器為一組，安裝至2個(gè)獨(dú)立的單元中，氧合后分2路進(jìn)入第三部分儲(chǔ)肝器中，最后分別經(jīng)動(dòng)脈以及門靜脈進(jìn)入肝臟[13]。該設(shè)備是通過(guò)管路將3個(gè)獨(dú)立的單元連接在一起，管路較長(zhǎng)，灌注液需求增加；安裝過(guò)程復(fù)雜，管路安裝不當(dāng)容易導(dǎo)致管路混入空氣、血液污染等問題的發(fā)生。與Liver Assist不同，DEVOCEAN-LIVER 2000將儲(chǔ)肝器、離心泵、氧合器以及管路整合至同一個(gè)套包中，僅需一步即可完成安裝，既方便消毒滅菌，又加快了臨床使用時(shí)的安裝速度。

綜上所述，DEVOCEAN-LIVER 2000能為肝臟在體外提供6 h穩(wěn)定的常溫機(jī)械灌注，使肝臟保持良好的狀態(tài)，符合移植的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)操作性明顯優(yōu)于國(guó)外的設(shè)備，且價(jià)格更優(yōu)惠，對(duì)于提高我國(guó)的肝移植手術(shù)數(shù)量與質(zhì)量具有重要的意義。后續(xù)將開展灌注時(shí)間更長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，以及不同類型的邊緣供肝的灌注實(shí)驗(yàn)和大型動(dòng)物的肝移植實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步確定DEVOCEAN-LIVER 2000的安全性、穩(wěn)定性與有效性。