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        HPLC-FLD測定歐前胡素對Rho123含量的影響

        2021-06-02 02:05:56曾丹嚴菁華金仁
        當代醫(yī)學 2021年15期
        關(guān)鍵詞:紫杉醇檢測

        曾丹,嚴菁,華金仁

        (江西省婦幼保健院,江西 南昌330006)

        近年來,惡性腫瘤發(fā)病率呈不斷升高的趨勢[1],因此,探索中藥中的抗腫瘤活性成分具有重要意義。有研究[2]發(fā)現(xiàn),香豆素中的歐前胡素可發(fā)揮明顯抗腫瘤作用。然而目前針對歐前胡素抗腫瘤活性的體外實驗仍較少,尤其是這一物質(zhì)對羅丹明123(Rho123)的影響情況,目前尚未形成統(tǒng)一的研究方法[3-4]。本研究探究HPLC-FLD測定歐前胡素對Rho123含量的影響,現(xiàn)報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實驗儀器HP100高效液相色譜儀(色譜柱為petruim C18柱,內(nèi)徑為5 μm,規(guī)格為250 mm×4.6 mm)、細胞培養(yǎng)箱、熒光檢測器、PHS-3C型pH計;離心機、BP-211D電子分析天平、多功能酶標儀。

        1.1.2 試劑Rho123對照品(Sigma公司,生產(chǎn)批號:102318560);鹽酸維拉帕米、對照用歐前胡素、考馬斯亮藍G-250、細胞裂解液、10%胎牛血清的RIMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、乙腈、0.25%EDTA-胰蛋白酶、磷酸及三乙胺。

        1.1.3 原材料 卵巢癌細胞株、卵巢癌耐紫杉醇的細胞株,均為本院實驗室保存的細胞株。

        1.2 方法

        1.2.1 確定HPLC-FLD測定Rho123含量的最佳條件 柱溫為40℃,所用流動相為乙腈-1%的三乙胺,以磷酸調(diào)整pH為3.0。控制流速為1 mL/min,每次進樣量為20 μL,檢測時的發(fā)射波長為546 nm,激發(fā)波長為485 nm。

        1.2.2 制備對照品溶液 從Rho123對照品中,精密稱取6.0 mg,置入棕色量瓶(容量為25 mL),以乙腈對其定容并搖勻,獲取Rho123儲備品溶液,其濃度240 μg/mL。以逐級稀釋方法,加入適量乙腈,稀釋Rho123儲備品溶液,獲得對照品溶液,濃度依次為30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8 μg/mL。將所有對照品均放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 樣品處理 ①細胞培養(yǎng):培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、鏈霉素及青霉素,將卵巢癌細胞株、卵巢癌耐紫杉醇的細胞株在6孔板中接種、培養(yǎng),到細胞于板內(nèi)生長、融合到70%~80%時,去除完全培養(yǎng)基,預(yù)先冷卻Hank’s平衡鹽溶液,清洗2次,加入500 μL Hank’s平衡鹽溶液,以細胞刮將細胞輕輕刮下,放在EP管(1.5 mL)內(nèi),在-80℃冰箱中冷凍保存,促使細胞破碎。反復實施3次融凍,在12 000 r/min速度下行10 min離心,獲得上清液。以1 000 ng/mL的Taxol的完全培養(yǎng)基,對人卵巢癌耐紫杉醇的細胞株進行培養(yǎng),離心耐藥性。在實驗前于無藥狀態(tài)下,共培養(yǎng)14 d。②空白細胞裂解液制備:取180 μL空白細胞裂解液,放在EP管(1.5 mL)內(nèi),將20 μL Rho123對照品溶液(對應(yīng)質(zhì)量濃度)加入其中,加入乙腈300 μL,二者混勻,渦旋處理3 min,14 000 r/min離心20 min,獲得上清液。采集上清液250 μL,和流動相500 μL混合均勻,渦旋處理3 min,用微孔濾膜(0.22 μm)對其過濾,準備檢測。③制作細胞懸液樣品:從待測腫瘤細胞裂解液內(nèi),稱取200 μL,加入乙腈300 μL,二者混勻,渦旋處理3 min,14 000 r/min離心20 min,獲得上清液。采集上清液250 μL,和流動相500 μL混合均勻,渦旋處理3 min,用微孔濾膜(0.22 μm)對其過濾,準備檢測。

        1.2.4 方法學考察 ①標準曲線制作:細胞懸液內(nèi),Rho123質(zhì)量濃度達3.516~600 ng/mL,線內(nèi)關(guān)系較理想,獲得標準曲線:Y=1.1987X-4.0045,R2=0.999 8。②定量下限測定:以逐級稀釋法進行處理,獲取Rho123定量下限為1.172 ng/mL,檢測下限為0.366 ng/mL。③專屬性考察:將Rho123細胞對照品溶液、來源不同的空白細胞裂解液、給予Rho123細胞裂解液樣品,處理樣品,準備檢測。

        1.2.5 歐前胡素對Rho123含量的影響 培養(yǎng)各種細胞,6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)接種、過夜,以不同濃度藥物溶液進行處理,另設(shè)1組用緩沖液處理的細胞,放在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi),孵育1 h,之后將之放在冰上10 min,促使反應(yīng)終止。于1 000 r/min速度下離心(注意溫度控制在4℃),離心時間5 min,之后將上清液去除,將冰冷緩沖液加入清洗,共2次。各孔中加Rho123緩沖液溶液1 mL,放在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi),孵育1 h,之后在冰上10 min,促使反應(yīng)終止。1 000 r/min離心(注意溫度控制在4℃),離心時間5 min,之后將上清液去除,將冰冷緩沖液加入清洗,共2次。加入500 μL緩沖液,以細胞刮將細胞輕輕刮下,放在EP管中(1.5 mL),在-80℃環(huán)境中凍存,促使細胞破碎。反復行3次凍融,12 000 r/min離心10 min,獲得上清液。樣品處理,獲取適量細胞懸液,根據(jù)Bradford蛋白濃度測量法,對蛋白進行定量測定。將各管細胞中Rho123濃度除以每管總蛋白含量,促使各管細胞數(shù)量不同造成的誤差消除。各組加樣順序為:陰性對照品:加1.0 mL細胞懸液、1.0 mL緩沖液、10 μL Rho123。

        實驗組:加1.0 mL細胞懸液、1.0 mL不同濃度藥液、10 μL Rho123。

        2 結(jié)果

        2.1 色譜分析 測定3種不同溶液色譜圖詳見圖1,分析物中,Rho123的色譜峰較大,且雜峰不會對其造成干擾,基線的噪音相對較小,方法具有良好的專屬性,保留時間為9.92 min,其分離度、特異度均良好。

        圖1 3種溶液色譜圖

        2.2 精密度試驗 持續(xù)3 d,以空白細胞液制作高、中、低質(zhì)控樣品,Rho123質(zhì)量濃度為3.516、75、600 ng/mL等濃度的標準樣品,每種樣品6份,處理分析,對濃度計算,考察檢測方法的日內(nèi)、日間精密度(日內(nèi)精密度測定方法為平行實施6次檢測,分析結(jié)果;日間精密度測定方法為每天實施1次測定,連續(xù)測定3 d,考察結(jié)果)。同批測定質(zhì)控樣品、標準曲線,根據(jù)標準曲線,計算質(zhì)控樣品濃度。經(jīng)測定,Rho123日內(nèi)精密度1.4%~4.9%,其日間精密度2.8%~7.4%,均低于10%,表明這一檢測方法的重復性良好,與相關(guān)要求符合。

        2.3 穩(wěn)定性分析 以空白細胞液,制作含有Rho123高、中、低質(zhì)控樣品,每種3份,將這些樣品在室溫下放置24 h,-80℃環(huán)境中儲存15 d,經(jīng)過3次冷凍及解凍循環(huán)等,再次檢測含量,分析穩(wěn)定性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),濃度為3.516 ng/mL的樣品,制備前為(3.41±0.28)ng/mL,RSD為9.1%,室溫下放置24 h后測量,為(3.41±0.31)ng/mL,RSD為9.2%,凍融后測定,為(3.39±0.30),RSD為9.4%,在-80℃環(huán)境中儲存15 d后為(3.19±0.28)ng/mL,RSD為8.8%。濃度為75 ng/mL的樣品,制備前為(76.51±0.45)ng/mL,RSD為0.58%,室溫下放置24 h后測量,為(76.39±0.56)ng/mL,RSD為0.89%,凍融后測定為(77.13±0.42)ng/mL,RSD為0.79%,在-80℃環(huán)境中儲存15 d后為(73.16±0.45)ng/mL,RSD為0.68%。濃度為600 ng/mL的樣品,制備前為(601.28±1.73)ng/mL,RSD為0.18%,室溫下放置24 h后測量,為(600.41±0.11)ng/mL,RSD為0.87%,凍融后測定,為(596.87±0.25)ng/mL,RSD為0.45%,在-80℃環(huán)境中儲存15 d后為(584.69±0.78)ng/mL,RSD為0.18%,表明樣品具有良好的穩(wěn)定性。

        2.4 回收率考察 以空白細胞液制作含有Rho123的高、中、低質(zhì)控樣品,每種6份,以乙腈制作濃度與Rho123高、中、低質(zhì)控溶液濃度相當?shù)膶φ召|(zhì)控樣品,每種6份,處理后從每種樣品中量取20 μL,實施HPLC測定,對色譜圖情況記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn),濃度為3.516 ng/mL時,其絕對回收率為12.6%,相對回收率為9.7%;濃度為75 ng/mL時,其絕對回收率為6.9%,相對回收率為7.3%;濃度為600 ng/mL時,其絕對回收率為3.9%,相對回收率為5.0%。

        2.5 歐前胡素對Rho123含量的影響 與卵巢癌細胞株比較,卵巢癌耐紫杉醇的細胞株內(nèi)Rho123的含量有所下降,說明卵巢癌耐紫杉醇的細胞株已形成耐藥性。而加入歐前胡素的耐藥細胞株中,其蓄積情況發(fā)生變化,且隨歐前胡素濃度升高,Rho123蓄積倍數(shù)逐漸升高,Rho123被排出細胞外的量越少,見表1。

        3 討論

        卵巢癌是常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率僅次于宮頸癌和宮體癌[5-6]。該病主要治療方式為手術(shù)治療、化療及靶向藥物治療。但卵巢癌一經(jīng)發(fā)現(xiàn)基本為晚期,治療后復發(fā)率高,預(yù)后差,病死率高[7],且細胞株易出現(xiàn)耐藥性,近年來領(lǐng)域內(nèi)對解決癌細胞耐藥性的問題加大了研究力度。

        隨診惡性腫瘤的發(fā)病率的升高,尋找中藥中的抗腫瘤活性成分成為當今的熱點。近期研究表明,香豆素中的歐前胡素通過體外實驗發(fā)現(xiàn)有明顯的抗腫瘤作用[8-9]。歐前胡素為白芷、當歸及獨活等中藥的主要成分,且有抗腫瘤、抗病毒、抗菌作用,可對腫瘤治療藥物的外排發(fā)揮抑制作用(P-gp介導)[10-11],促使紫杉醇、長春新堿等藥物在生物體內(nèi)的利用度增加。Chen等[12-13]發(fā)現(xiàn)歐前胡素能通過調(diào)節(jié)細胞色素P450酶而引起小鼠上皮癌細胞和前胃癌細胞DNA的斷裂。Siegel等[14]發(fā)現(xiàn)歐前胡素能夠誘導細胞的凋亡,其作用機制是通過抑制HL-60細胞中Bcl-2的表達,引起下游凋亡基因的級聯(lián)反應(yīng)。但針對歐前胡素抗腫瘤活性的體外實驗仍不多,需進一步驗證,包括對其有效濃度的測定,且尚缺乏引起抗腫瘤效應(yīng)的分子機制的研究。

        表1 歐前胡素對Rho123含量的影響(n=6)

        Rho屬于羅丹明系列燃料之一,分子結(jié)構(gòu)為剛性平面樣,且熒光量子產(chǎn)率較高,因此,熒光較強,屬于熒光探針物[15-16]。該物質(zhì)屬于P-糖蛋白經(jīng)典底物,可穿透細胞膜,對活細胞線粒體予以選擇性染色,故而Rho123可評價P-糖蛋白的功能、活性。本研究中,主要是運用Rho含量可反映機體P-gp外排的抑制作用[17-18],以了解歐前胡素在卵巢癌患者治療中的應(yīng)用價值。

        Rho123的測量方法較多,常用方法為流式細胞儀檢測、HPLC檢測、熒光分光光度法檢測、LC-MS檢測,多數(shù)檢測方法費用較高,靈敏度不佳,且操作過程相對復雜[19-20]。本研究結(jié)果表明,和卵巢癌細胞株比,卵巢癌耐紫杉醇的細胞株內(nèi)Rho123的含量下降,而加入歐前胡素后,耐藥細胞株中的蓄積情況發(fā)生變化,且歐前胡素濃度越高Rho123蓄積倍數(shù)逐漸升高。提示,隨著歐前胡素用量不斷增加,Rho123蓄積量也逐漸增加,其被排出到體外的量逐漸減少,因此,這一方法可評估P-糖蛋白的功能與活性,以及細胞凋亡情況、口服藥物吸收與分泌情況等,從而為藥物作用情況、藥代動力學的研究提供參考依據(jù)。另外,P-糖蛋白為重要外排轉(zhuǎn)運蛋白,很多卵巢癌治療的一線藥物如長春花生物堿、紫杉烷類、多柔比星等,均可引發(fā)腫瘤多藥耐藥性問題。本研究結(jié)果顯示,在耐藥卵巢癌細胞中,歐前胡素對Rho123含量有明顯影響,隨著歐前胡素濃度升高,Rho123被排出的可能性越低,歐前胡素的應(yīng)用,有望改善卵巢癌細胞的耐藥性問題。

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