曾丹，嚴菁，華金仁

（江西省婦幼保健院，江西 南昌330006）

近年來，惡性腫瘤發(fā)病率呈不斷升高的趨勢[1]，因此，探索中藥中的抗腫瘤活性成分具有重要意義。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，香豆素中的歐前胡素可發(fā)揮明顯抗腫瘤作用。然而目前針對歐前胡素抗腫瘤活性的體外實驗仍較少，尤其是這一物質(zhì)對羅丹明123（Rho123）的影響情況，目前尚未形成統(tǒng)一的研究方法[3-4]。本研究探究HPLC-FLD測定歐前胡素對Rho123含量的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器HP100高效液相色譜儀（色譜柱為petruim C18柱，內(nèi)徑為5 μm，規(guī)格為250 mm×4.6 mm）、細胞培養(yǎng)箱、熒光檢測器、PHS-3C型pH計；離心機、BP-211D電子分析天平、多功能酶標儀。

1.1.2 試劑Rho123對照品（Sigma公司，生產(chǎn)批號：102318560）；鹽酸維拉帕米、對照用歐前胡素、考馬斯亮藍G-250、細胞裂解液、10%胎牛血清的RIMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、乙腈、0.25%EDTA-胰蛋白酶、磷酸及三乙胺。

1.1.3 原材料 卵巢癌細胞株、卵巢癌耐紫杉醇的細胞株，均為本院實驗室保存的細胞株。

1.2 方法

1.2.1 確定HPLC-FLD測定Rho123含量的最佳條件 柱溫為40℃，所用流動相為乙腈-1%的三乙胺，以磷酸調(diào)整pH為3.0。控制流速為1 mL/min，每次進樣量為20 μL，檢測時的發(fā)射波長為546 nm，激發(fā)波長為485 nm。

1.2.2 制備對照品溶液 從Rho123對照品中，精密稱取6.0 mg，置入棕色量瓶（容量為25 mL），以乙腈對其定容并搖勻，獲取Rho123儲備品溶液，其濃度240 μg/mL。以逐級稀釋方法，加入適量乙腈，稀釋Rho123儲備品溶液，獲得對照品溶液，濃度依次為30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8 μg/mL。將所有對照品均放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品處理 ①細胞培養(yǎng)：培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、鏈霉素及青霉素，將卵巢癌細胞株、卵巢癌耐紫杉醇的細胞株在6孔板中接種、培養(yǎng)，到細胞于板內(nèi)生長、融合到70%～80%時，去除完全培養(yǎng)基，預(yù)先冷卻Hank’s平衡鹽溶液，清洗2次，加入500 μL Hank’s平衡鹽溶液，以細胞刮將細胞輕輕刮下，放在EP管（1.5 mL）內(nèi)，在-80℃冰箱中冷凍保存，促使細胞破碎。反復實施3次融凍，在12 000 r/min速度下行10 min離心，獲得上清液。以1 000 ng/mL的Taxol的完全培養(yǎng)基，對人卵巢癌耐紫杉醇的細胞株進行培養(yǎng)，離心耐藥性。在實驗前于無藥狀態(tài)下，共培養(yǎng)14 d。②空白細胞裂解液制備：取180 μL空白細胞裂解液，放在EP管（1.5 mL）內(nèi)，將20 μL Rho123對照品溶液（對應(yīng)質(zhì)量濃度）加入其中，加入乙腈300 μL，二者混勻，渦旋處理3 min，14 000 r/min離心20 min，獲得上清液。采集上清液250 μL，和流動相500 μL混合均勻，渦旋處理3 min，用微孔濾膜（0.22 μm）對其過濾，準備檢測。③制作細胞懸液樣品：從待測腫瘤細胞裂解液內(nèi)，稱取200 μL，加入乙腈300 μL，二者混勻，渦旋處理3 min，14 000 r/min離心20 min，獲得上清液。采集上清液250 μL，和流動相500 μL混合均勻，渦旋處理3 min，用微孔濾膜（0.22 μm）對其過濾，準備檢測。

1.2.4 方法學考察 ①標準曲線制作：細胞懸液內(nèi)，Rho123質(zhì)量濃度達3.516～600 ng/mL，線內(nèi)關(guān)系較理想，獲得標準曲線：Y=1.1987X-4.0045，R2=0.999 8。②定量下限測定：以逐級稀釋法進行處理，獲取Rho123定量下限為1.172 ng/mL，檢測下限為0.366 ng/mL。③專屬性考察：將Rho123細胞對照品溶液、來源不同的空白細胞裂解液、給予Rho123細胞裂解液樣品，處理樣品，準備檢測。

1.2.5 歐前胡素對Rho123含量的影響 培養(yǎng)各種細胞，6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)接種、過夜，以不同濃度藥物溶液進行處理，另設(shè)1組用緩沖液處理的細胞，放在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育1 h，之后將之放在冰上10 min，促使反應(yīng)終止。于1 000 r/min速度下離心（注意溫度控制在4℃），離心時間5 min，之后將上清液去除，將冰冷緩沖液加入清洗，共2次。各孔中加Rho123緩沖液溶液1 mL，放在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育1 h，之后在冰上10 min，促使反應(yīng)終止。1 000 r/min離心（注意溫度控制在4℃），離心時間5 min，之后將上清液去除，將冰冷緩沖液加入清洗，共2次。加入500 μL緩沖液，以細胞刮將細胞輕輕刮下，放在EP管中（1.5 mL），在-80℃環(huán)境中凍存，促使細胞破碎。反復行3次凍融，12 000 r/min離心10 min，獲得上清液。樣品處理，獲取適量細胞懸液，根據(jù)Bradford蛋白濃度測量法，對蛋白進行定量測定。將各管細胞中Rho123濃度除以每管總蛋白含量，促使各管細胞數(shù)量不同造成的誤差消除。各組加樣順序為：陰性對照品：加1.0 mL細胞懸液、1.0 mL緩沖液、10 μL Rho123。

實驗組：加1.0 mL細胞懸液、1.0 mL不同濃度藥液、10 μL Rho123。

2 結(jié)果

2.1 色譜分析 測定3種不同溶液色譜圖詳見圖1，分析物中，Rho123的色譜峰較大，且雜峰不會對其造成干擾，基線的噪音相對較小，方法具有良好的專屬性，保留時間為9.92 min，其分離度、特異度均良好。

圖1 3種溶液色譜圖

2.2 精密度試驗 持續(xù)3 d，以空白細胞液制作高、中、低質(zhì)控樣品，Rho123質(zhì)量濃度為3.516、75、600 ng/mL等濃度的標準樣品，每種樣品6份，處理分析，對濃度計算，考察檢測方法的日內(nèi)、日間精密度（日內(nèi)精密度測定方法為平行實施6次檢測，分析結(jié)果；日間精密度測定方法為每天實施1次測定，連續(xù)測定3 d，考察結(jié)果）。同批測定質(zhì)控樣品、標準曲線，根據(jù)標準曲線，計算質(zhì)控樣品濃度。經(jīng)測定，Rho123日內(nèi)精密度1.4%～4.9%，其日間精密度2.8%～7.4%，均低于10%，表明這一檢測方法的重復性良好，與相關(guān)要求符合。

2.3 穩(wěn)定性分析 以空白細胞液，制作含有Rho123高、中、低質(zhì)控樣品，每種3份，將這些樣品在室溫下放置24 h，-80℃環(huán)境中儲存15 d，經(jīng)過3次冷凍及解凍循環(huán)等，再次檢測含量，分析穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度為3.516 ng/mL的樣品，制備前為（3.41±0.28）ng/mL，RSD為9.1%，室溫下放置24 h后測量，為（3.41±0.31）ng/mL，RSD為9.2%，凍融后測定，為（3.39±0.30），RSD為9.4%，在-80℃環(huán)境中儲存15 d后為（3.19±0.28）ng/mL，RSD為8.8%。濃度為75 ng/mL的樣品，制備前為（76.51±0.45）ng/mL，RSD為0.58%，室溫下放置24 h后測量，為（76.39±0.56）ng/mL，RSD為0.89%，凍融后測定為（77.13±0.42）ng/mL，RSD為0.79%，在-80℃環(huán)境中儲存15 d后為（73.16±0.45）ng/mL，RSD為0.68%。濃度為600 ng/mL的樣品，制備前為（601.28±1.73）ng/mL，RSD為0.18%，室溫下放置24 h后測量，為（600.41±0.11）ng/mL，RSD為0.87%，凍融后測定，為（596.87±0.25）ng/mL，RSD為0.45%，在-80℃環(huán)境中儲存15 d后為（584.69±0.78）ng/mL，RSD為0.18%，表明樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 回收率考察 以空白細胞液制作含有Rho123的高、中、低質(zhì)控樣品，每種6份，以乙腈制作濃度與Rho123高、中、低質(zhì)控溶液濃度相當?shù)膶φ召|(zhì)控樣品，每種6份，處理后從每種樣品中量取20 μL，實施HPLC測定，對色譜圖情況記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度為3.516 ng/mL時，其絕對回收率為12.6%，相對回收率為9.7%；濃度為75 ng/mL時，其絕對回收率為6.9%，相對回收率為7.3%；濃度為600 ng/mL時，其絕對回收率為3.9%，相對回收率為5.0%。

2.5 歐前胡素對Rho123含量的影響 與卵巢癌細胞株比較，卵巢癌耐紫杉醇的細胞株內(nèi)Rho123的含量有所下降，說明卵巢癌耐紫杉醇的細胞株已形成耐藥性。而加入歐前胡素的耐藥細胞株中，其蓄積情況發(fā)生變化，且隨歐前胡素濃度升高，Rho123蓄積倍數(shù)逐漸升高，Rho123被排出細胞外的量越少，見表1。

3 討論

卵巢癌是常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌和宮體癌[5-6]。該病主要治療方式為手術(shù)治療、化療及靶向藥物治療。但卵巢癌一經(jīng)發(fā)現(xiàn)基本為晚期，治療后復發(fā)率高，預(yù)后差，病死率高[7]，且細胞株易出現(xiàn)耐藥性，近年來領(lǐng)域內(nèi)對解決癌細胞耐藥性的問題加大了研究力度。

隨診惡性腫瘤的發(fā)病率的升高，尋找中藥中的抗腫瘤活性成分成為當今的熱點。近期研究表明，香豆素中的歐前胡素通過體外實驗發(fā)現(xiàn)有明顯的抗腫瘤作用[8-9]。歐前胡素為白芷、當歸及獨活等中藥的主要成分，且有抗腫瘤、抗病毒、抗菌作用，可對腫瘤治療藥物的外排發(fā)揮抑制作用（P-gp介導）[10-11]，促使紫杉醇、長春新堿等藥物在生物體內(nèi)的利用度增加。Chen等［12-13］發(fā)現(xiàn)歐前胡素能通過調(diào)節(jié)細胞色素P450酶而引起小鼠上皮癌細胞和前胃癌細胞DNA的斷裂。Siegel等［14］發(fā)現(xiàn)歐前胡素能夠誘導細胞的凋亡，其作用機制是通過抑制HL-60細胞中Bcl-2的表達，引起下游凋亡基因的級聯(lián)反應(yīng)。但針對歐前胡素抗腫瘤活性的體外實驗仍不多，需進一步驗證，包括對其有效濃度的測定，且尚缺乏引起抗腫瘤效應(yīng)的分子機制的研究。

表1 歐前胡素對Rho123含量的影響（n=6）

Rho屬于羅丹明系列燃料之一，分子結(jié)構(gòu)為剛性平面樣，且熒光量子產(chǎn)率較高，因此，熒光較強，屬于熒光探針物［15-16］。該物質(zhì)屬于P-糖蛋白經(jīng)典底物，可穿透細胞膜，對活細胞線粒體予以選擇性染色，故而Rho123可評價P-糖蛋白的功能、活性。本研究中，主要是運用Rho含量可反映機體P-gp外排的抑制作用［17-18］，以了解歐前胡素在卵巢癌患者治療中的應(yīng)用價值。

Rho123的測量方法較多，常用方法為流式細胞儀檢測、HPLC檢測、熒光分光光度法檢測、LC-MS檢測，多數(shù)檢測方法費用較高，靈敏度不佳，且操作過程相對復雜［19-20］。本研究結(jié)果表明，和卵巢癌細胞株比，卵巢癌耐紫杉醇的細胞株內(nèi)Rho123的含量下降，而加入歐前胡素后，耐藥細胞株中的蓄積情況發(fā)生變化，且歐前胡素濃度越高Rho123蓄積倍數(shù)逐漸升高。提示，隨著歐前胡素用量不斷增加，Rho123蓄積量也逐漸增加，其被排出到體外的量逐漸減少，因此，這一方法可評估P-糖蛋白的功能與活性，以及細胞凋亡情況、口服藥物吸收與分泌情況等，從而為藥物作用情況、藥代動力學的研究提供參考依據(jù)。另外，P-糖蛋白為重要外排轉(zhuǎn)運蛋白，很多卵巢癌治療的一線藥物如長春花生物堿、紫杉烷類、多柔比星等，均可引發(fā)腫瘤多藥耐藥性問題。本研究結(jié)果顯示，在耐藥卵巢癌細胞中，歐前胡素對Rho123含量有明顯影響，隨著歐前胡素濃度升高，Rho123被排出的可能性越低，歐前胡素的應(yīng)用，有望改善卵巢癌細胞的耐藥性問題。