羅丹 覃慧芳 葉婧 趙錦明 秦翊翔 藍如束

廣西壯族自治區(qū)結(jié)核病報告發(fā)病率盡管近年來以3.39%的年均遞減率逐年下降，但仍居于全國各省(市、自治區(qū))前列[1]。廣西壯族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌抗結(jié)核藥物耐藥率雖低于全國平均水平[2]，但是結(jié)核病患者基數(shù)大，結(jié)核病耐藥問題給本地區(qū)結(jié)核病防控帶來嚴峻挑戰(zhàn)。本研究運用全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)的方法，探討結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變情況及其與基因型的相關(guān)性，以期為耐藥結(jié)核病的早診斷、早治療提供科學參考。

資料和方法

一、菌株來源

對2017年廣西壯族自治區(qū)結(jié)核病耐藥監(jiān)測點的所有涂陽肺結(jié)核患者痰標本進行分離培養(yǎng)，獲得陽性培養(yǎng)物,最終獲得721株結(jié)核分枝桿菌。1株由中國疾病預防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室提供的H37Rv結(jié)核分枝桿菌標準菌株作為對照。

二、實驗方法

1.菌株培養(yǎng)：將含有菌液的凍存管放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中復蘇。吸取0.1～0.15 ml菌液均勻接種于培養(yǎng)管的羅氏培養(yǎng)基上，每株菌接種2支培養(yǎng)管，將培養(yǎng)管放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。具體操作參考《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[3]。培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

2.DNA的提?。翰捎肅TAB法進行DNA的提取[4]，提取的DNA置-20 ℃保存?zhèn)溆?，作為WGS的DNA模板。

3.WGS：由北京諾禾致源生物科技股份有限公司完成檢測，利用高通量二代Illumina 測序技術(shù)平臺，進行DNA 片段文庫構(gòu)建，雙端測序，PE150，深度至少200×，每個樣品總測序深度數(shù)據(jù)量≥1 G Clean Data。測序原始數(shù)據(jù)分別用Scythe (https://github.com/ucdavisbioinformatics/Scythe)和Sickle (https://github.com/najoshi/sickle)兩個軟件進行過濾處理，去除低質(zhì)量堿基(質(zhì)量值≤38)、N 堿基比例>10 bp、與Adapter 之間overlap 超過15 bp和可能來源于宿主的reads，得到的Clean Data用于后續(xù)分析。以H37Rv菌株的全基因組序列(NC_000962.2)作為參考模板，使用Samtools軟件進行比對獲得每株菌株單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)[5]。將SNP數(shù)據(jù)與已報道結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變數(shù)據(jù)庫進行比對[6]，獲得每株菌株對一線抗結(jié)核藥品耐藥突變基因的類型。菌株分型是將每株菌株SNP與H37Rv(NC_000962.2)進行比對，獲得每株菌株的基因型[7]。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的整理與分析，計數(shù)資料采用“率或構(gòu)成比(%)”表示， 組間差異的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

結(jié) 果

一、結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐藥基因突變類型

WGS結(jié)果顯示，721株結(jié)核分枝桿菌中，223株發(fā)生了5種抗結(jié)核藥品耐藥相關(guān)基因突變，總突變率為30.93%，其中單藥突變126株(56.50%，126/223)，多藥聯(lián)合突變97株(43.50%，97/223)。在5種抗結(jié)核藥品中，鏈霉素的單藥突變比例最高(44.00%)，其次是異煙肼(40.85%)、吡嗪酰胺(33.33%)、乙胺丁醇(17.19%)、利福平(17.05%)；多藥聯(lián)合突變中，利福平的多藥聯(lián)合突變比例(82.95%，73/88)高于其他藥品(χ2=25.660，P=0.000)(表1)。

二、結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因突變位點分布情況

分別對5種藥品的耐藥基因突變情況分析得出，突變率最高的基因為katG基因，突變率為16.09%(116/721)，其次由高到底依次為：rpoB(12.21%，88/721)、embB(8.46%，61/721)、rpsL(6.10%，44/721)、rrs(4.72%，34/721)、pncA(3.61%，26/721)(表2)。

表1 2017年廣西分離結(jié)核分枝桿菌對5種抗結(jié)核藥品耐藥基因突變類型

對突變率前5位的耐藥基因katG、rpoB、embB、rpsL、rrsL進行突變位點分析顯示，在katG基因突變的116株菌株中，單位點突變占94.83%(110/116)，多位點聯(lián)合突變占5.17%(6/116)。突變率最高的位點為katG315，突變率12.34%，占katG基因總突變的85.34%(99/116)，其中以AGC→ACC堿基突變?yōu)橹?，占katG315位點突變的89.90%(89/99)。在rpoB基因突變的88株菌株中，單位點突變與聯(lián)合突變之比為3:1(66/22),突變率最高的位點為rpoB450，突變率4.85%，占rpoB基因總突變的39.77%(35/88)，突變堿基均為TCG→TTG，其次的突變位點為rpoB445(占23.86%，21/88)，rpoB452(占5.68%，5/88)，發(fā)生前 3 個位點突變的菌株數(shù)占rpoB總突變菌株數(shù)的69.32%。在embB基因突變的61株菌株中,單位點突變31株(50.82%)，聯(lián)合突變30株(49.18%)；embB306位點突變率最高(4.02%，29/721)，占embB基因總突變的50.82%，多位點聯(lián)合突變以embB378+embC270突變?yōu)橹?60.00%，18/30)。在rpsL基因突變的44株菌株中,單位點突變41株，占93.18%；以rpsL43位點突變?yōu)橹?，突變率?.27%，占rpsL總突變的86.36%(38/44)。在rrs基因突變的31株菌株中,以rrs462單位點突變和rrs516單位點突變?yōu)橹?67.74%，21/31)。突變率前5位的位點分布情況見表3。

吡嗪酰胺耐藥基因突變率為3.74%(27/721)。在27株發(fā)生吡嗪酰胺耐藥基因突變的菌株中，26株(96.30%)發(fā)生pncA基因突變，僅有1株(3.70%)發(fā)生pnaD基因突變。突變形式以單位點突變?yōu)橹?92.59%，25/27)。

表3 721株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因突變位點分布情況

表4 721株結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變在不同基因型中的分布

表5 721株結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變位點在不同基因型中的分布

三、結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變與基因型的相關(guān)性

721株結(jié)核分枝桿菌中，北京基因型菌株409株(56.73%)，非北京基因型菌株312株(43.27%)。對突變率較高的5個耐藥基因katG、rpoB、embB、rpsL、rrs的突變情況在不同基因型中的分布進行分析發(fā)現(xiàn)，rpsL基因突變在2種基因型中分布的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=32.090，P=0.000)(表4)。

對突變率前5位的耐藥基因位點katG315、rpoB450、rpsL43、embB306、rpoB445在不同基因型中的分布進行分析顯示，rpsL43位點和rpoB445位點在北京基因型中的突變率高于非北京基因型(χ2=26.992，P=0.000；χ2=7.404，P=0.007)(表5)。

討 論

國內(nèi)外對一線抗結(jié)核藥品耐藥基因突變的研究較為廣泛。相關(guān)研究表明，不同地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因是否突變以及突變位點均存在較大差異[8]。廣西壯族自治區(qū)地處祖國西南邊陲，結(jié)核病疫情嚴重，耐藥結(jié)核病給本地區(qū)結(jié)核病控制帶來嚴峻挑戰(zhàn)?；蛲蛔兪墙Y(jié)核分枝桿菌耐藥的主要機制，而目前尚未有關(guān)于廣西壯族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變情況的研究報道，本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌相關(guān)耐藥基因突變與結(jié)核分枝桿菌基因型是否相關(guān)亦未得知。本研究采用WGS的方法，探討了廣西壯族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌對5種一線抗結(jié)核藥品異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因突變情況及其與基因型的相關(guān)性，為耐藥結(jié)核病的早診斷、早治療提供技術(shù)依據(jù)。

本研究的5種一線抗結(jié)核藥品中，鏈霉素和異煙肼發(fā)生單藥突變的比例較大，分別占總突變的44.00%和40.85%，而利福平和乙胺丁醇則以與其他藥品發(fā)生聯(lián)合突變?yōu)橹?，分別占82.95%和82.81%。因此，在發(fā)生利福平和乙胺丁醇耐藥基因突變的菌株中，應警惕其他藥品相關(guān)基因同時發(fā)生突變的存在，為臨床用藥提供參考。對各藥品相關(guān)耐藥基因的分析顯示，突變率在前5位的基因分別是異煙肼katG、利福平rpoB、乙胺丁醇embB、鏈霉素rpsL和rrs基因，與國內(nèi)外相關(guān)研究基本相同[9-10]。值得注意的是，本研究rpoB基因突變率為12.21%，與國內(nèi)數(shù)據(jù)相比較高[11]，然而，前期在本地區(qū)開展的結(jié)核病耐藥性監(jiān)測結(jié)果并未顯示本地區(qū)利福平耐藥表型水平高于全國平均水平，考慮可能與本地區(qū)rpoB基因突變的位點以rpoB450和rpoB445為主有關(guān)，相關(guān)研究表明絕大多數(shù)rpoB耐藥相關(guān)突變發(fā)生于利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)，即密碼子507～533這一81 bp區(qū)域，占全部rpoB耐藥相關(guān)突變的95%～97%，其中最常見的是密碼子516、526、531[12-13]，而本地區(qū)rpoB突變位點位于RRDR區(qū)以外，此外，耐藥的產(chǎn)生不僅與突變位點有關(guān)，不同堿基突變類型導致的耐藥水平也不同。對各基因發(fā)生突變位點的進一步分析發(fā)現(xiàn)，katG、rpoB、rpsL和rrsL基因均以單位點突變?yōu)橹?，而embB基因約50%發(fā)生多位點聯(lián)合突變，尤其以embB378+embC270聯(lián)合突變?yōu)橹?。提示在進行耐藥結(jié)核病分子診斷方法的制定時應充分考慮各位點突變的特征，本結(jié)果可為耐藥分子診斷制劑的研發(fā)提供一定的參考。

本研究異煙肼耐藥基因katG突變位點、氨基酸變化與相關(guān)研究結(jié)果一致[14-15]。katG基因突變導致異煙肼耐藥的原因主要是315位點的絲氨酸轉(zhuǎn)變成蘇氨酸，使得katG編碼的過氧化氫-過氧化物酶活性下降或喪失，導致異煙肼無法活化為異煙酸，致使結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)了異煙肼fabG1和ahpC基因發(fā)生了突變，值得注意的是，在6株異煙肼耐藥基因聯(lián)合突變的菌株中，均有fabG1基因突變的發(fā)生，這對廣西壯族自治區(qū)耐藥結(jié)核病的基因診斷有一定的參考意義。利福平耐藥基因rpoB突變率最高的位點為450，堿基由TCG 突變?yōu)門TG，氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)變成亮氨酸，此外，rpoB445位點突變率也較高，這與Nwofor 等[17]的研究結(jié)果不相同，可能與研究的地區(qū)、民族差異性有關(guān)，結(jié)核分枝桿菌耐藥率及耐藥基因突變特征在不同民族中可能存在差異[18-19]。乙胺丁醇耐藥基因embB突變位點為406，堿基主要由 ATG 轉(zhuǎn)換為 GTG、ATA、ATC、ATT，氨基酸由甲硫氨酸轉(zhuǎn)變成纈氨酸和異亮氨酸。這與相關(guān)報道[20-21]相符。鏈霉素耐藥基因rpsL和rrs的突變最常見的位點分別是43、1401[22]。本研究中rpsL與rrs的突變位點及氨基酸變化與相關(guān)研究結(jié)果一致[23-24]。rpsL和rrs的突變分別導致糖體蛋白S12與核糖體16S RNA的編碼發(fā)生障礙，從而使結(jié)核分枝桿菌對鏈霉素產(chǎn)生耐藥[25]。本研究在721株結(jié)核分枝桿菌中僅發(fā)現(xiàn)有27株發(fā)生了吡嗪酰胺耐藥相關(guān)基因突變，突變率不高，突變基因也僅有pncA和pnaD2個，突變形式也比較單一，以單位點突變?yōu)橹鳌１狙芯拷Y(jié)果一定程度上反映了本地區(qū)吡嗪酰胺的耐藥水平，說明一線抗結(jié)核藥品吡嗪酰胺在本地區(qū)仍具有較高的應用價值。

本研究在探討耐藥基因突變與基因型的相關(guān)性中發(fā)現(xiàn)，突變率前五位的5個基因中，鏈霉素rpsL基因突變在北京基因型中的發(fā)生率高于非北京基因型；在突變率前五位的5個耐藥基因位點中，鏈霉素rpsL43位點和利福平rpoB445位點突變率在北京基因型中也高于非北京基因型，這與北京基因型更容易傳播耐藥菌株的結(jié)論具有一定的一致性，本研究未發(fā)現(xiàn)異煙肼和利福平耐藥基因突變與基因型有相關(guān)性，考慮有可能與樣本的局限性有關(guān)，可進一步增大樣本含量進行研究。然而，北京基因型是否更容易發(fā)生上述相關(guān)耐藥基因的突變，仍需要進一步研究證實。

本研究通過WGS揭示了廣西壯族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌對5種一線抗結(jié)核藥品利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和鏈霉素耐藥相關(guān)基因突變的分子特征，在分子水平上快速確定其對一線抗結(jié)核藥品基因型耐藥情況，與傳統(tǒng)藥物敏感性試驗6～10周的檢測時間相比，極大縮短了檢測報告時間，大大縮短了耐藥結(jié)核病患者的確診周期，具有較高的臨床應用以及推廣價值。隨著分子檢測技術(shù)的日趨完善，其在結(jié)核病耐藥篩查、相關(guān)耐藥基因的分子快速診斷試劑盒的研發(fā)與應用方面具有重要的應用前景。