伍細言，彭新華，胡子文，禹虹，范烺（湖南省婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，長沙410008）

男性不育指男女雙方未采取任何避孕措施，性生活正常，1年及以上女方未受孕。男性不育原因錯綜復雜，現(xiàn)有的男科實驗室無法檢測精子亞細胞形態(tài)的微小損傷，精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）能從精子DNA層面評價精子質(zhì)量，被認為是一種評價精液質(zhì)量和預測男性生育能力的有效指標［1］。精子DFI與精子產(chǎn)生過程中染色體異常組裝、精子的氧化應激損傷或凋亡等有關(guān)［2］。研究表明，男性精子DNA損傷的增加，不僅會導致男性不育，亦可能影響胚胎發(fā)育，導致反復流產(chǎn)或出生缺陷增加、子代染色體異常的風險增加，甚至還會影響體外受精（in vitro fertilization，IVF）的結(jié)局［3-4］。本研究回顧性分析精子DFI數(shù)據(jù)，探討精子DFI在評估男性生育力及監(jiān)測抗氧化藥物對高精子DFI男性不育患者療效中的應用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年2月至2019年7月于我院就診的2 122例男性患者。（1）正常生育組（62例）：夫妻雙方在我院行孕前檢查，雙方檢查結(jié)果正常，并排除其他全身性疾病，電話回訪女方在1年內(nèi)懷孕并正常生育的男性。（2）女方復發(fā)性流產(chǎn)的不育組（61例）：夫妻雙方染色體正常，女方先兆流產(chǎn)及習慣性流產(chǎn)＞2次，于我院查因的男性；（3）不育行IVF組（1 999例）：因單純男性不育因素行IVF的男性，或因女性單純的輸卵管或盆腔因素且女性年齡＜40歲行IVF的男性。根據(jù)精子DFI檢測結(jié)果，不育行IVF組中430例高精子DFI（＞15%）男性進行了抗氧化治療。

1.2 主要儀器與試劑 FACS Calibur流式細胞儀（BD公司）；人類精子核完整性染色試劑盒（浙江星博生物科技公司）。

1.3 標本采集與DFI檢測 患者禁欲2～7 d后手淫法收集完整的精液于干燥取精杯內(nèi)，于當天或凍存于-20℃冰箱解凍后在流式細胞儀上采用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法（sperm chromatin structure assay，SCSA）檢測精子DFI。SCSA被認為是檢測精子DNA損傷的金標準［5］。其原理是：受損的精子DNA在酸的作用下變性形成單鏈，而正常精子DNA維持雙鏈。吖啶橙（AO）與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，而與單鏈DNA結(jié)合發(fā)出黃色或紅色熒光。精子經(jīng)AO染色后用流式細胞儀進行分析。具體操作為：取適量精液用樣本稀釋液（A液）稀釋至100μL，使精子終濃度為（1～2）×106/mL；加入200μL酸溶液（B液，置于冰上操作），準確計時30 s之后，加入600μL吖啶橙染色液（C液）染色5 min，用流式細胞儀分析。每份標本至少計數(shù)5 000個精子，流式細胞儀經(jīng)軟件分析后自動給出每份標本的精子DFI值。430例高精子DFI（＞15%）男性進行抗氧化藥物治療。治療方法：口服天然維生素E，每天3次，每次100 mg，規(guī)范治療3個月。

1.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行。先用Kolmogorov-Smirnova和Shapiro-Wilk法檢驗數(shù)據(jù)分布狀態(tài)，呈偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（IQR）］表示。采用Kruskal-Wallis H檢驗分析三組間精子DFI值的差異性，兩兩比較用Nemenyi檢驗。抗氧化藥物治療效果觀察用Fisher分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組精子DFI結(jié)果比較 正常生育組、女方復發(fā)性流產(chǎn)的不育組及不育行IVF組精子DFI結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（H=18.050，P＜0.01）；兩兩比較顯示，不育行IVF組男性精子DFI高于正常生育組（χ2=-4.017，P＜0.01）。見表1。

表1 正常生育組、女方復發(fā)性流產(chǎn)的不育組及不育行IVF組精子DFI結(jié)果比較

2.2 抗氧化藥物對精子DFI的治療效果 430例高精子DFI男性抗氧化藥物治療前后精子DFI值的變化見表2，高精子DFI男性進行抗氧化藥物治療后精子DFI下降。

表2 抗氧化藥物治療前后精子DFI值的比較

3 討論

精子DFI檢測作為精液常規(guī)檢查的重要補充，目前已在臨床實驗室常規(guī)開展。研究表明，精子DFI與精液常規(guī)參數(shù)存在一定的相關(guān)性［6］，精液常規(guī)只能初步反映精子質(zhì)量，而精子DFI能夠從分子層面反映精子DNA的完整性。精子DFI增高，可反映男性生育力降低，同時增加女方復發(fā)性流產(chǎn)風險，影響IVF助孕結(jié)局［7-9］。而年齡、泌尿生殖道感染、生活方式、環(huán)境污染物等多種因素都可以引起男性精子DFI增高［10］。研究表明，正常生育組、復發(fā)性流產(chǎn)組及不育行IVF組間男性精子DFI存在差異，且不育行IVF組的精子DFI高于正常生育組，而復發(fā)性流產(chǎn)組的男性精子DFI介于正常生育組和不育行IVF組間，表明精子DFI增高與復發(fā)性流產(chǎn)和男性生育力降低密切相關(guān)。

引起復發(fā)性流產(chǎn)的因素復雜，有遺傳因素、子宮病變、內(nèi)分泌失調(diào)、自身免疫病等，其中還有近50%原因不明。研究顯示，男性精子DFI增高可能是不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的重要因素［7］。本研究亦顯示，復發(fā)性流產(chǎn)組的男性精子DFI高于正常生育組，但未達到顯著差異水平。這可能與本研究納入的復發(fā)性流產(chǎn)組未剔除女方因素有關(guān)。但此結(jié)果也提示，復發(fā)性流產(chǎn)夫婦在臨床診治中應重視男性因素，尤其是精子DNA完整性的影響。

本研究中的不育行IVF組以男性因素為主，其精子DFI高于正常生育組，再次佐證了精子DFI可以用于評估男性生育力，且高精子DFI患者應該進行相應的治療。

研究表明，氧化應激反應是導致精子質(zhì)量下降及精子DNA損傷的重要因素。1979年，Jones等［11］首先提出，人類精子對氧化應激特別敏感，精子暴露于過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）分子環(huán)境中，可導致精子細胞膜結(jié)構(gòu)受損，引起兩種嚴重的“連鎖反應”：一方面，促進精子細胞的凋亡過程，引起精子細胞核碎裂，核DNA碎片增多；另一方面，導致精子核DNA直接暴露于精漿中的ROS類物質(zhì)中，精子DNA遭受ROS的正面攻擊而引起大范圍的DNA雙鏈的斷裂破壞，引起精子遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)受損、功能缺陷而導致男性不育。

雖然有大量研究致力于改善精子DFI，但是目前尚無明確的治療指南。大量研究結(jié)果顯示［12-15］，應用抗氧化藥物對于體內(nèi)過多氧自由基導致的氧化應激反應具有十分明顯的抑制效果，可以有效保護精子DNA及相關(guān)功能。但抗氧化治療是否顯著降低精子DFI，相關(guān)研究較少。在我們的臨床診療中，對高精子DFI患者多通過如下綜合措施進行治療，包括：（1）調(diào)整不健康的生活習慣：包括改變久坐、熬夜、缺少鍛煉、抽煙、喝酒等不良生活方式。（2）服用抗氧化藥物如維生素E、維生素C、葡萄糖酸鋅、輔酶Q10等。結(jié)果顯示，68.8%的病例經(jīng)綜合治療后精子DFI均有不同程度的下降，提示抗氧化治療能在一定程度上改善精子DFI。另有31.2%的男性精子DFI無改善，可能與患者依從性差或其他未知因素有關(guān)，未來我們需要進一步查找引起精子DFI增高的潛在因素?？傊?，精子DFI可在一定程度上反映男性生育能力，而對高精子DFI患者通過服用抗氧化藥物，加強宣教，改變不良習慣，可以有效降低男性精子DFI，并最終改善妊娠結(jié)局。