趙媛，李代紅，劉偉，劉純，艾麗萍（.天津市第一中心醫(yī)院輸血科，天津3009；.天津市秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，天津30039）

ABO抗原系統(tǒng)是人類(lèi)最重要的血型系統(tǒng)，與輸血安全和器官移植等密切相關(guān)。非ABO同型輸血可能導(dǎo)致急性溶血反應(yīng)、遲發(fā)性溶血反應(yīng)、輸血無(wú)效等嚴(yán)重后果。除了正常的ABO血型外，還存在著由于基因突變引起的ABO亞型，包括A2和A2B的A2亞型是最常見(jiàn)的ABO亞型。為探討開(kāi)展分子生物學(xué)方法檢測(cè)A2抗原的必要性，本研究主要調(diào)查ABO血型正反定型相符的A和AB型患者紅細(xì)胞表面A抗原類(lèi)型。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 天津市第一中心醫(yī)院2020年1月至8月ABO血型檢測(cè)中，正反定型相符A型和AB型的患者3 024例，男1 467例，女1 557例?；颊吣挲g1～97歲，成人2 543例，兒童481例。分子生物學(xué)確定A2和A2B血型的輸血患者作為觀察組，臨床診斷為同病種且當(dāng)日輸血的患者作為對(duì)照組，排除外科失血＞50 mL或嚴(yán)重感染患者。每輸入2 U懸浮紅細(xì)胞，輸血后24 h內(nèi)血紅蛋白（Hb）升高≥10 g/L視為輸血有效。

1.2 主要儀器與試劑 2005-1型離心機(jī)（珠海貝索公司）；X-15R型離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；Erytra全自動(dòng)血型配血儀（西班牙戴安娜公司）；DDY-Ⅲ2型電泳儀（北京六一生物科技公司）；ALPHAImager-EP凝膠成像分析儀（美國(guó)阿爾法公司）；AB9700PCR儀、ABI3730基因測(cè)序儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

微柱凝膠血型卡（西班牙戴安娜公司）；雙花扁豆植物凝集素抗A1（荷蘭Sanquin公司）；DNA提取試劑盒（北京天根生化公司）；ABO-SSP試劑盒、ABO基因擴(kuò)增與測(cè)序引物（天津秀鵬生物科技公司）。

1.3 標(biāo)本采集與處理

1.3.1 血清學(xué)檢測(cè) 用EDTA-K2抗凝血標(biāo)本進(jìn)行ABO正反定型、A1抗原檢測(cè)，按照《AABB技術(shù)手冊(cè)》（第18版）［1］嚴(yán)格操作。

1.3.2 分子生物學(xué)檢測(cè) 抗A1陰性標(biāo)本嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，調(diào)整DNA濃度30～50 ng/μL，A260nm/A280nm為1.6～2.0。用人類(lèi)ABO血型基因分型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR-SSP基因分型，110μL dNTP-Buffer工作液、0.9μL Taq酶（5 units/μL）、10μL DNA組成混合液，采用10μL作為反應(yīng)體系。PCR產(chǎn)物進(jìn)行25 g/L瓊脂糖凝膠電泳并用紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。同時(shí)委托天津市秀鵬生物技術(shù)公司用基因測(cè)序儀對(duì)ABO基因第1～7外顯子測(cè)序，擴(kuò)增引物序列為5′-GCTG CCTCTGGAAGGGTGGT-3′和5′-ACCAAGGGCGGGA GGGG-3′。PCR反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性120 s；96℃變性20 s，68℃退火60 s，循環(huán)5次；96℃變性20 s，65℃退火45 s，72℃延伸30 s，循環(huán)10次；96℃變性20 s，62℃退火45 s，72℃延伸30 s，循環(huán)15次；72℃延伸180 s。擴(kuò)增產(chǎn)物純化：37℃20 min，80℃20 min，4℃保存。結(jié)果由Chro-mas 2.31軟件進(jìn)行序列分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行。Tmin≥5，N≥40時(shí)使用卡方檢驗(yàn)；1≤Tmin＜5，N≥40時(shí)用校正卡方檢驗(yàn)；Tmin＜1或N＜40時(shí)用Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血型結(jié)果 3 024例正反定型相符A和AB型中，血清學(xué)檢出A2和A2B 48例（1.59%）。618例AB型中血清學(xué)檢出A2B血型32例（5.18%），2 406例A型中血清學(xué)檢出A2血型16例（0.67%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=64.1，P＜0.01）。

根據(jù)PCR-SSP與基因測(cè)序結(jié)果，共確認(rèn)A2和A2B 16例（0.53%），PCR-SSP結(jié)果（圖1）與基因測(cè)序結(jié)果（圖2）相符?；蛐停?例A102/O01，2例A102/O02，2 例 A101/B101，23 例 A102/B101，1 例A201/O01，3例A205/O01，2例A205/O02，2例A201/B101，8例A205/B101。16例A2基因中A205（81.25%）發(fā)生頻率高于A201（18.75%）。A2B血型檢出10例（1.62%），高于A2血型檢出6例（0.25%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.0，P＜0.01）。A2及A2B表型和基因型發(fā)生頻率與2013年的一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)人群血型調(diào)查［2］對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

圖1 部分A2和A2 B血型PCR-SSP電泳結(jié)果

圖2 A201、A 205基因型部分測(cè)序結(jié)果

表1 中國(guó)人群A2和A2 B發(fā)生頻率比對(duì)結(jié)果

2.2 輸血情況 16例A2（A2B）患者中有11例接受輸血治療，輸注懸浮紅細(xì)胞共31.5 U，經(jīng)檢測(cè)獻(xiàn)血員血液A1抗原全部陽(yáng)性。5例（45.45%）發(fā)生輸血不良反應(yīng)，其中2例（A201/B101、A205/O02）發(fā)生遲發(fā)性血清學(xué)反應(yīng)均為輸血后9～13 d血漿中檢出抗A1抗體；3例發(fā)生輸血無(wú)效（27.27%）。當(dāng)日同病種輸血患者23例，2例（8.69%）發(fā)生輸血不良反應(yīng)，2例發(fā)生輸血無(wú)效（8.69%）。輸血不良反應(yīng)發(fā)生情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；輸血有效率低于當(dāng)日同病種輸血患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

A2和A2B血型是ABO系統(tǒng)最常見(jiàn)亞型，國(guó)內(nèi)外研究顯示正確檢測(cè)A2和A2B血型有利于提高器官移植安全［3-4］和臨床輸血安全［5-7］。血清學(xué)AB型人群中A2B發(fā)生率高于A型人群中A2發(fā)生率，已有報(bào)道中［8-10］同樣存在此種與孟德?tīng)栠z傳規(guī)律不符的不平衡現(xiàn)象。A1和A2血型的A抗原存在數(shù)量上的差異，每一個(gè)紅細(xì)胞表面A抗原數(shù)量通常是：A1，8×105～12×105；A2，1×105～4×105；A1B，5×105～9×105；A2B，1×105［11］。目前臨床上通常依賴于限定外源性植物凝集素抗A1濃度檢測(cè)紅細(xì)胞表面A抗原數(shù)量來(lái)區(qū)分A1和A2血型。因此，推測(cè)由于AB型紅細(xì)胞表面A抗原數(shù)量低于A型紅細(xì)胞，使A2B血型更易被血清學(xué)方法檢出。

本研究PCR-SSP方法與基因測(cè)序結(jié)果一致，A2基因發(fā)生率0.53%與近年報(bào)道［6，12-13］相符，顯示中國(guó)人群A2基因并非罕見(jiàn)。本研究共檢出A205基因型13例，A201基因型3例，未檢出A2其他基因型；與中國(guó)其他地區(qū)的研究結(jié)果相符［2，14］。本研究顯示A2與A2B基因型發(fā)生率同樣存在不平衡現(xiàn)象，有研究認(rèn)為這一不平衡是由于人群中A204基因型的存在導(dǎo)致［15］，但本次研究并未涉及該基因型。啟動(dòng)子甲基化、反義RNA、組織特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白、外顯子1上游4 kb的小衛(wèi)星增強(qiáng)區(qū)等因素都可能參與ABO血型基因調(diào)控［1］，對(duì)基因頻率的影響有待進(jìn)一步研究。

本研究中發(fā)生輸血不良反應(yīng)的A2和A2B血型患者遲發(fā)性血清學(xué)反應(yīng)占40%，高于該類(lèi)型在整體人群中的發(fā)生頻率。普遍認(rèn)為A201是針對(duì)A1抗原產(chǎn)生抗A1抗體的最主要A2基因型，但本次發(fā)現(xiàn)的輸血病例中A205也會(huì)產(chǎn)生抗A1抗體。本研究中輸血治療效果以24 h內(nèi)Hb為判定標(biāo)準(zhǔn)，輸血有效率未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，受判定標(biāo)準(zhǔn)局限和臨床干擾因素影響無(wú)法對(duì)輸血24 h后效果繼續(xù)評(píng)價(jià)，對(duì)遲發(fā)型血清學(xué)反應(yīng)對(duì)輸血治療效果的影響有待今后繼續(xù)研究。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)人群中存在一定比例的A2和A2B血型，PCR-SSP方法可以準(zhǔn)確鑒定血型基因型，輸血前準(zhǔn)確鑒定A2和A2B血型有利于提高臨床輸血安全。