譚雅文，劉繁，孫詩(shī)瑤，謝萍，劉國(guó)文

(1.深圳市第二人民醫(yī)院(深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院)甲狀腺乳腺外科， 廣東深圳 518000；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，北京 100069)

據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)報(bào)告》，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例226萬(wàn)例，已經(jīng)超越肺癌成為全球發(fā)病第一的惡性腫瘤[1]。 同年，乳腺癌全球相關(guān)死亡病例約68萬(wàn)例，成為全球第五的癌癥致死病因[1]。乳腺癌在分子水平上具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，臨床上根據(jù)免疫組化標(biāo)記的異同，將乳腺癌分為4種不同的亞型，三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer， TNBC)是其中一類(lèi)特殊的分子分型，其缺乏雌激素受體、孕激素受體以及人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)的表達(dá)，大約占乳腺癌總數(shù)的16%[2]。由于TNBC缺乏以上受體的表達(dá)，其對(duì)現(xiàn)有的內(nèi)分泌藥物、靶向藥物均無(wú)效，目前其主要治療仍然依靠手術(shù)及化療，加之其在已知的乳腺癌分型中侵襲性最強(qiáng)，早期復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，故TNBC的預(yù)后很差[3-4]。

Kazusa cDNA計(jì)劃是一個(gè)旨在開(kāi)展廣泛的人類(lèi) cDNAs 測(cè)序的項(xiàng)目，來(lái)預(yù)測(cè)未知的人類(lèi)基因的編碼序列，科學(xué)家將此計(jì)劃新發(fā)現(xiàn)的基因命名為“KIAA”基因，也被稱(chēng)作未知基因，到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了兩千多個(gè)KIAA基因[5]。近年來(lái)KIAA基因的研究主要著眼于識(shí)別其編碼的蛋白質(zhì)的生理功能。KIAA0101基因，又被叫做PCNA 相關(guān)因子(PCNA associated factor，p15 PAF)， 編碼增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白[6]，該蛋白為DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的必要蛋白。KIAA0101參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程，如DNA損傷修復(fù)[7]、細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖[8]。它的異常表達(dá)已經(jīng)被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，也被認(rèn)為是多種惡性腫瘤的癌基因，在多種惡性腫瘤的惡性進(jìn)程、預(yù)后[6]以及耐藥[9]中發(fā)揮著重要作用。有研究報(bào)道[10]，KIAA0101在乳腺癌中高表達(dá)，但是暫時(shí)沒(méi)有KIAA0101與三陰性乳腺癌的相關(guān)報(bào)道。本課題聯(lián)合使用多種數(shù)據(jù)庫(kù)分析KIAA0101在TNBC中的表達(dá)及其對(duì)該類(lèi)患者預(yù)后的影響，以期為進(jìn)一步研究KIAA0101在TNBC中的作用機(jī)制提供線索和思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)資料下載

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中搜索人三陰性乳腺癌數(shù)據(jù)集，通過(guò)對(duì)表達(dá)譜芯片的信息進(jìn)行分析，確定將來(lái)源于GSE38959和GSE27447中27例非腫瘤乳腺癌樣本和35例三陰性乳腺癌樣本數(shù)據(jù)納入本研究。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

利用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) 對(duì)來(lái)自GEO的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合， 并以|log FC|>1、P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，然后使用在線分析網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進(jìn)行韋恩分析，得到重疊的差異表達(dá)基因。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)檢索WIF1與RERGL在TNBC癌組織中的表達(dá)情況，檢索條件為：① Cancer: Breast invasive carcinoma；② Gene：WIF1; RERGL；③ Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)中檢索PMCHL1和KIAA0101在乳腺癌組織中的表達(dá)情況， 檢索條件為：① Cancer：Breast invasive carcinoma； ② Gene：PMCHL1；KIAA0101； ③ Matched Normal data: Match TCGA normal and GTEx data。

1.4 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析

通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu)獲取KIAA0101基因在乳腺癌內(nèi)的表達(dá)情況，通過(guò)Expression選項(xiàng)中sample type、major subclasses、cancer stage和nodal metastasis status等分類(lèi)預(yù)測(cè)KIAA0101在三陰性等乳腺癌中的表達(dá)情況。

1.5 免疫浸潤(rùn)

在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中下載TCGA樣本中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平矩陣，將KIAA0101表達(dá)水平與檢索結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，得到其與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性。

1.6 生存分析

使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析，檢索KIAA0101基因，得到三陰性乳腺癌患者差異表達(dá)KIAA0101的生存曲線。限定條件：總生存期(overall survival，OS)和無(wú)復(fù)發(fā)生存率(recurrence-free survival，RFS)，進(jìn)行預(yù)后分析。

2 結(jié) 果

2.1 篩選差異表達(dá)基因

對(duì)GSE38959和GSE27447芯片進(jìn)行韋恩分析得到25個(gè)重疊的差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的基因有12個(gè)(圖1A)，下調(diào)基因有13個(gè)(圖1B)。GO功能富集分析表明這些重疊的差異基因在胞外區(qū)域、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、負(fù)向調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路、正向調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、Wnt-蛋白質(zhì)結(jié)合等方面起作用(圖1C)。差異柱狀圖分別顯示了兩個(gè)數(shù)據(jù)集中重疊的差異基因表達(dá)情況，數(shù)據(jù)集GSE38959中KIAA0101上調(diào)最顯著，數(shù)據(jù)集GSE27447中PMCHL1上調(diào)最顯著(圖1D)。

A

B

C

D

2.2 在常見(jiàn)腫瘤組織中的PMCHL1和KIAA0101 mRNA水平

用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PMCHL1和KIAA0101在人體各器官腫瘤組織中的mRNA水平進(jìn)行了分析，結(jié)果提示PMCHL1 mRNA在TNBC癌組織中表達(dá)升高不明顯，P值不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)，而KIAA0101在TNBC癌組織中升高顯著，較正常組織升高明顯(P<0.05)(圖2B)。

A

B

2.3 KIAA0101 mRNA水平與TNBC進(jìn)展相關(guān)

通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)，基于sample type、major subclasses、cancer stage和nodal metastasis status等分類(lèi)比對(duì)了KIAA0101 mRNA在癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)KIAA0101 mRNA在乳腺癌組織中的含量顯著高于癌旁組織(P<0.001)(圖3A)，并且在TNBC不同亞型和不同臨床分期中KIAA0101 mRNA在癌組織中表達(dá)量也均高于癌旁組織(圖3B和3C)。此外，分析數(shù)據(jù)顯示與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(N0)相比，N1-N3期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的KIAA0101 mRNA出現(xiàn)升高(P<0.001)(圖3D)。

A

B

C

D

2.4 KIAA0101的表達(dá)量和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量呈正相關(guān)

使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)KIAA0101與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)聯(lián)系進(jìn)行在線分析， 發(fā)現(xiàn)KIAA0101的表達(dá)情況與TNBC中B細(xì)胞(P<0.001)、中性粒細(xì)胞 (P=0.02) 浸潤(rùn)均呈正相關(guān)， 并且與B細(xì)胞的相關(guān)性最強(qiáng)。與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)不相關(guān)(圖4)。

圖4 KIAA0101 mRNA表達(dá)量對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

2.5 KIAA0101的表達(dá)對(duì)TNBC患者預(yù)后的影響

通過(guò)對(duì)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)在TNBC中高表達(dá)KIAA0101患者的OS較低表達(dá)患者顯著縮短， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.45,P=0.0073)。此外，在TNBC樣本中，KIAA0101與患者RFS無(wú)明顯聯(lián)系，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.81,P=0.27)(圖5)。

A

B

3 討 論

乳腺癌作為一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，發(fā)病率、死亡率正在逐年增加。2020年，全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，新增的乳腺癌相關(guān)死亡病例約68.5萬(wàn)例[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年中國(guó)乳腺癌新發(fā)病例和死亡人數(shù)分別約占全世界的12.2%和9.6%[11-12]。而TNBC與其他亞型乳腺癌相比，具有腫瘤組織學(xué)分級(jí)高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，由于其侵襲性高，很多患者在初診時(shí)臨床分期相對(duì)較晚[13]。目前，TNBC的有效治療手段非常有限，手術(shù)是其局部治療的最佳方案，而化療則是目前唯一有效的輔助治療方法。雖然乳腺癌治療手段層出不窮，但針對(duì)TNBC的治療沒(méi)有突破性進(jìn)展，由于治療手段的匱乏，TNBC的總體預(yù)后仍然沒(méi)有得到改善。這就促使科研工作者不斷尋找治療TNBC的新方法，探尋與TNBC有關(guān)的差異基因表達(dá)，以尋找新的腫瘤治療靶點(diǎn)。

KIAA0101含有一個(gè)保守的PCNA結(jié)合基，與CDK抑制劑p21競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 PCNA[9]。有研究證明，KIAA0101可以與BRCA1結(jié)合，從而影響中心體的數(shù)量[10]。此外，KIAA0101的轉(zhuǎn)錄變體1可以抑制p53激活，從而阻止使用阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14-15]。還有研究證明KIAA0101 的過(guò)表達(dá)，可以激活 PI3K/AKT/mTOR 通路，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬，從而導(dǎo)致順鉑類(lèi)藥物的耐藥[9]。KIAA0101在多種性腫瘤中表達(dá)升高， 如胃癌[16]、 乳腺癌[10]、 食管癌[17]、肝癌[18]，并可能與癌癥患者的預(yù)后相關(guān)[6]。

本研究通過(guò)使用GEO、GEPIA、UALCAN、TIMER和 Kaplan-Meier Plotter 等數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘KIAA0101基因表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)，探尋其在三陰性乳腺癌中的表達(dá)、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及與預(yù)后的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，癌變組織的SORT1水平顯著高于非癌變組織，SORT1 mRNA水平在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)升高，并且發(fā)現(xiàn)在所有三陰性乳腺癌的亞型中均出現(xiàn)升高，尤其是TNBC-LAR亞型中升高最為顯著。在人蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Protein Atlas， HPA)(https://www.proteinatlas.org)內(nèi)檢索關(guān)鍵字“KIAA0101”， 選擇 “Pathology” 模塊， 并未找到KIAA0101抗體在三陰性乳腺癌中蛋白免疫組化結(jié)果。但Kais[10]和Wang[19]等研究發(fā)現(xiàn)，KIAA0101在乳腺癌中高表達(dá)，那么在接下來(lái)的研究中，可利用臨床病理樣本，從蛋白表達(dá)水平上分析 KIAA0101與TNBC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

其后，使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)KIAA0101與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系進(jìn)行在線分析，發(fā)現(xiàn)KIAA0101的表達(dá)與B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，表達(dá)量增加，在B細(xì)胞中尤為明顯，這可能為尋找TNBC免疫治療新靶點(diǎn)提供一個(gè)新思路。

最后通過(guò)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)KIAA0101會(huì)對(duì)患者總生存期產(chǎn)生不良影響，即從轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)KIAA0101的表達(dá)會(huì)TNBC患者帶來(lái)不良的預(yù)后，由此進(jìn)一步證明KIAA0101基因可能有促進(jìn)TNBC進(jìn)展的作用。然而，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來(lái)自芯片檢測(cè)結(jié)果，相關(guān)結(jié)論尚有待后續(xù)驗(yàn)證。

同時(shí)， 關(guān)于KIAA0101如何與其他分子發(fā)生相互作用來(lái)影響TNBC的發(fā)展需要進(jìn)一步的研究； KIAA0101在TNBC中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用也需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)支撐。為了進(jìn)一步明確KIAA0101與TNBC之間的關(guān)系，接下來(lái)將利用臨床樣本，從蛋白表達(dá)水平上分析其與TNBC的關(guān)系，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系。

綜上，KIAA0101在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)升高，且與其臨床分期呈正相關(guān)；另外，它還影響患者的生存預(yù)后，與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)，在一定程度上提示了KIAA0101作為三陰性乳腺癌潛在治療靶點(diǎn)的可能，也為進(jìn)一步研究KIAA0101基因與三陰性乳腺癌的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，希望為三陰性乳腺癌的治療提供一定的理論依據(jù)，并開(kāi)拓新的治療思路。