彭邵鋒，吳 紅，陸 佳，馬 力，陳永忠，鄔榮領(lǐng)，王甘春

（1.北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004；3.國家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004；4.木本油料資源利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；5.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004）

油茶Camellia oleiferaAbel.屬于山茶科山茶屬植物，是我國南方特有的經(jīng)濟(jì)林樹種，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料樹種。油茶主要分布于我國長江流域及以南的14個(gè)?。▍^(qū)、市）的642個(gè)縣（市、區(qū)），其中以湖南、江西、廣西分布面積最大。近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)快速增長和人民生活水平的不斷提高，食用植物油消費(fèi)總量持續(xù)增長，需求缺口不斷擴(kuò)大，對(duì)外依存度高達(dá)70%以上，在一定程度上影響我國糧油戰(zhàn)略安全。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，一方面有利于充分利用我國豐富的山地資源，緩解耕地壓力，全面落實(shí)“藏糧于地、藏糧于技”戰(zhàn)略，維護(hù)國家糧油安全；另一方面，對(duì)有效增加優(yōu)質(zhì)食用油供給[1-2]、提高國民健康素質(zhì)、增加農(nóng)民收入、助力鄉(xiāng)村振興、改善生態(tài)環(huán)境、建設(shè)美麗中國等方面具有十分重要的意義。油茶產(chǎn)業(yè)也因此得到了黨和國家的高度重視，國家相關(guān)部委和地方各級(jí)政府先后出臺(tái)了一系列政策文件和扶持措施，油茶產(chǎn)業(yè)進(jìn)入發(fā)展快車道，油茶種植面積、產(chǎn)量和產(chǎn)值得到迅速增加和提高。

油茶的主要產(chǎn)品——茶油是高級(jí)保健食用油，其脂肪酸組成合理，以不飽和脂肪酸為主[3-4]，油酸、亞油酸、亞麻酸等含量較高。除脂肪酸外，茶油中還含有甾醇[5]、維生素E[6]和角鯊烯[7]等多種功能成分。茶油因營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、易于吸收、便于儲(chǔ)藏而受到廣大消費(fèi)者的青睞和喜愛。油脂和茶皂素是油茶種子中最重要的兩種經(jīng)濟(jì)成分。隨著油茶科學(xué)研究特別是新一代良種選育和精深加工技術(shù)的縱深推進(jìn)[8-9]，具有高含油、高脂肪酸成分等優(yōu)異性狀的品種選育以及茶皂素等有效成分的高效提取與利用成為當(dāng)前油茶研究的新方向。但如何精準(zhǔn)測(cè)定油茶單顆或者更少量種仁中油脂和茶皂素的含量，成為當(dāng)前油茶科研工作者急需解決的現(xiàn)實(shí)問題。

油茶種子油脂含量測(cè)定的常用方法是索式抽提法[10]，該方法所需樣品量較大（約2 g），同時(shí)需要消耗大量正己烷或石油醚等有毒有害溶劑，耗費(fèi)時(shí)間長（約6 h），提取效率低。對(duì)于油茶種子的茶皂素含量測(cè)定，一方面有效分離難度較大，另一方面會(huì)受到種子油脂的干擾，因此目前茶皂素提取采用的原料多為去除油脂后的餅粕，通過含水乙醇索式抽提后，再采用紫外可見分光光度法測(cè)定皂素含量[11]，而油茶種子的茶皂素含量則是通過反推的方式計(jì)算而來，難免產(chǎn)生過程誤差?？梢姡槍?duì)單顆油茶種子，甚至更少量樣品中油脂和茶皂素的提取和測(cè)定，傳統(tǒng)測(cè)定方法已明顯不適應(yīng)，且暫無相關(guān)報(bào)道。

為了建立油茶半微量種仁的油脂和茶皂素含量同步測(cè)定方法，本研究采用商業(yè)化的脂肪提取試劑盒提取油茶半微量種仁中的油脂和茶皂素，通過與傳統(tǒng)的少量樣品油脂提取方法進(jìn)行比較研究，同時(shí)充分參考和吸收常量樣品油脂含量測(cè)定的Folch法、Bligh法等方法的優(yōu)點(diǎn)，從而建立起快速、穩(wěn)定的油脂和茶皂素含量同步測(cè)定方法，為油茶品質(zhì)研究和良種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自于湖南省長沙縣路口鎮(zhèn)明月村湖南省林業(yè)科學(xué)院油茶基地的油茶樹。油茶樹栽植于2010年，株行距3 m×3 m，撫育管理?xiàng)l件較好。2017年10月23日，在預(yù)先標(biāo)定好的油茶無性系的5棵樣株的樹冠中上部，每棵樣株隨機(jī)采集果實(shí)3個(gè)，混合裝入密封袋，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，及時(shí)將果實(shí)果皮剝開，取出種子，再剝離種皮，置于-80℃冰箱中保存。試驗(yàn)時(shí)，根據(jù)需要隨機(jī)選擇若干種仁，經(jīng)冷凍干燥后，再采用混合型研磨儀粉碎，備用。

濃硫酸、無水硫酸鈉、香草醛、80%乙醇、BF3甲醇溶液等均為分析純，上海國藥有限責(zé)任公司；去離子水，自制；正己烷（色譜純），Sigma；茶皂素為標(biāo)準(zhǔn)品；37種脂肪酸（＞99%）、十七烷酸（＞99%）、十七烷酸甲酯（＞99%）均為標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma；脂肪提取試劑盒，Sigma。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（SCION），布魯克；分析天平（ME104E），梅特勒托利多；混合型研磨儀（MM 400），德國萊馳；紫外可見分光光度計(jì)（SPECORD 210 PLUS），德國耶拿；脂肪測(cè)定儀（SZC-D），上海楚柏。

1.3 方 法

1.3.1 油脂提取率和茶皂素提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確取0.200 0 g樣品（100目）和3.9 mL提取液，一并加入10 mL的離心管中，同時(shí)加入0.1 mL濃度為10 mg/mL的十七烷酸三甘酯，超聲提取，10 000 r/min離心5 min，取上層清液2 mL定容到50 mL，采用紫外吸收光度法測(cè)定其中茶皂素的含量。取下層清液于錐形瓶中，旋蒸去除溶劑，油脂稱質(zhì)量，獲得油脂質(zhì)量。在錐形瓶中加入1 mL質(zhì)量濃度為10 g/L的氫氧化鈉甲醇溶液，搖勻，冷凝條件下100℃皂化10 min，加入2 mL 14%的BF3甲醇溶液，60℃下甲酯化5 min，加入正己烷4 mL，飽和氯化鈉溶液至瓶頸，邊加邊震蕩，分層后取上層溶液0.2 mL稀釋到2 mL進(jìn)行氣相色譜分析，測(cè)定油脂中各脂肪酸的含量。

1.3.2 油茶種仁中油脂、茶皂素的傳統(tǒng)測(cè)定方法

油脂含量的測(cè)定依照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》（GB 5009.6—2016）執(zhí)行。Folch法參考文獻(xiàn)進(jìn)行試驗(yàn)[12]。茶皂素含量采用脫油后的餅粕，采用70%乙醇在索式抽提器中提取4 h后，采用紫外分光光度法測(cè)定[13-14]。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

以提取溫度、提取時(shí)間和料液比為因素，研究溫度20～40℃、提取時(shí)間3～20 min、料液比1∶10～1∶30 g/mL條件下油脂和茶皂素的提取率。

1.3.4 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素條件的基礎(chǔ)上，采用design expert 8.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)，其中提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和料液比（X3）為自變量，油脂的提取率（Y1）和茶皂素的提取率（Y2）為響應(yīng)值，各因素和水平如表1所示。

表1 Box-Benhnken 試驗(yàn)因素及水平Table 1 Box-Benhnken test factors and their levels

1.3.5 方法學(xué)考察

1.3.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將購自Sigma公司的37種脂肪酸甲酯的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品分別調(diào)配成質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50和1.00 mg/L的5個(gè)梯度，加入質(zhì)量濃度為0.02 mg/L的十七烷酸。設(shè)定如下色譜條件：毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.25 μm）HP-88，進(jìn)樣量1 μL，分流比1:20，進(jìn)樣器溫度為250℃，He流速為1 mL/min，升溫程序50℃保持1 min，10 ℃/min升到170℃，再以3 ℃/min的升溫速度升到230℃，保溫23 min。對(duì)脂肪酸甲酯混標(biāo)進(jìn)行采集，以單個(gè)脂肪酸甲酯的濃度為橫坐標(biāo)（X），以各種脂肪酸甲酯與十七烷酸甲酯的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。

1.3.5.2 重復(fù)性

取油茶種仁6份，每份精確稱取0.1 g，分別以2 mL脂肪提取液對(duì)其進(jìn)行提取，同時(shí)加入用脂肪提取試劑配制的質(zhì)量濃度為10 g/L的十七烷酸0.2 mL內(nèi)標(biāo)震蕩提取3次，合并濾液在60℃下皂化10 min，100℃下甲酯化3 min，趁熱用N2吹干，正己烷定容至5 mL。各取1μL注入氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄脂肪酸與C17:0甲酯的峰面積的比值。

1.3.5.3 加標(biāo)回收率

取油茶種仁6份，每份精確稱取0.1 g，分別以2 mL脂肪提取液對(duì)其進(jìn)行提取，同時(shí)加入質(zhì)量濃度為10 g/L的十七烷酸0.2 mL內(nèi)標(biāo)震蕩提取3次，分別加入1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、5 000 μg的十七烷酸三甘酯，合并濾液在60℃下皂化10 min，100℃下甲酯化3 min，趁熱用N2吹干，正己烷定容至5 mL。各取1 μL注入氣相色譜儀進(jìn)行分析，記錄C17∶0的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在料液比1∶20 g/mL、提取時(shí)間10 min的條件下，考察了不同提取溫度對(duì)油茶種仁中的油脂和茶皂素提取率的影響。由圖1可以看出，油脂和茶皂素的溶出規(guī)律基本一致，這為油茶種仁油脂和茶皂素含量的同步測(cè)定提供了可能。從總體看，隨著提取溫度的不斷升高，油脂和茶皂素的提取率均呈先升后降的趨勢(shì)，溫度對(duì)茶皂素的提取率影響更為顯著；相同溫度時(shí)，茶皂素的提取率稍低于油脂。在誤差方面，茶皂素提取率誤差較油脂提取率誤差大，但都低于2%，而當(dāng)溫度在35℃以下時(shí)，油脂提取率的誤差值低于1%。可見，該方法提取油脂和茶皂素均具有較好的穩(wěn)定性。由于溫度高于30℃時(shí)，油脂和茶皂素的提取率都略有降低，且誤差增大，因此，在后續(xù)的因素實(shí)驗(yàn)中選擇30℃作為提取溫度。

圖1 提取溫度對(duì)油茶油脂和茶皂素提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on oil and tea saponin yield

在料液比1∶20 g/mL、提取溫度35 ℃的條件下，考察了不同提取時(shí)間對(duì)油茶種仁中的油脂和茶皂素提取率的影響。由圖2可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，油脂和茶皂素的提取率均呈現(xiàn)出先迅速增加后緩慢下降的規(guī)律，且兩者變化趨勢(shì)基本一致。自開始至3 min內(nèi)，油脂和茶皂素的溶出速度很快，3 min時(shí)油脂和茶皂素的提取率均大于90%；在9 min時(shí)，溶出基本完全；往后隨著提取時(shí)間的增加，油脂和茶皂素的提取率反而緩慢降低；20 min時(shí)，油脂和茶皂素的提取率降低超過1%，且實(shí)驗(yàn)誤差也明顯增大。因此，在后續(xù)的因素實(shí)驗(yàn)中選擇9 min作為提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對(duì)油茶油脂和茶皂素提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on oil and tea saponin yield

在溫度35 ℃、提取時(shí)間9 min的條件下，考察了不同液料比對(duì)油茶種仁中的油脂和茶皂素提取率的影響，結(jié)果見圖3。由于本實(shí)驗(yàn)中針對(duì)的是單顆油茶種仁，質(zhì)量固定且很小，不同的料液比則需通過調(diào)整提取液的體積來實(shí)現(xiàn)，也就是說在選定提取溶劑的基礎(chǔ)上，通過提高液料比的方式來研究不同料液比對(duì)油脂和茶皂素提取率的影響。從圖3可以看出，隨著液料比的增加，油脂和茶皂素的提取率均呈先上升后下降的規(guī)律，當(dāng)液料比小于20∶1 mL/g時(shí)，油脂的提取率均比茶皂素的提取率高；當(dāng)液料比從20∶1 mL/g增加至25∶1 mL/g時(shí)，油脂的提取率明顯降低，茶皂素的提取率稍有升高。因此，選料液比20∶1 mL/g為后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖3 料液比對(duì)油脂和茶皂素提取率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on oil and tea saponin yield

2.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

通過三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)各提取條件進(jìn)行優(yōu)化。以油脂提取率（Y1）和茶皂素提取率（Y2）為響應(yīng)值，對(duì)多元二次回歸方程進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。用Design expert 8.0對(duì)模型進(jìn)行分析，結(jié)果見表3～4。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸分析，得到回歸方程為：

式中：Y1和Y2為響應(yīng)值，分別為油脂和茶皂素的提取率（%）；X1、X2和X3分別為提取時(shí)間、提取溫度和提取液料比3個(gè)因素。油脂模型的R2為0.994 2，失擬誤差為0.084，不顯著；茶皂素模型的R2為0.998 2，失擬誤差為8.325E-003，不顯著。表明該模型能很好地?cái)M合油脂和茶皂素的提取條件。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental results

通過模型計(jì)算，得到最佳的油脂和茶皂素的綜合提取條件為：溫度31.35℃，時(shí)間10.41 min，料液比1∶21.9 g/mL。得到的油脂和茶皂素的提取率分別為99.11%和97.73%。

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，對(duì)油脂提取率和茶皂素提取率在最佳預(yù)測(cè)條件下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。驗(yàn)證過程中，設(shè)定條件為：溫度31.35℃，時(shí)間10.41 min，料液比1∶21.9 g/mL，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，油脂提取率為（99.22±1.62）%，茶皂素提取率為（97.86±2.03）%，與預(yù)測(cè)值基本一致，表明該模型能很好地預(yù)測(cè)半微量油茶仁中油脂和茶皂素的提取率。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 線 性

在最優(yōu)條件下，對(duì)方法進(jìn)行線性驗(yàn)證。棕櫚酸：y=0.990 0x+0.001 5，R2=0.999 7。硬脂酸：y=1.010 0x+0.001 6，R2=0.999 8。油酸：y=0.970 0x+0.003 3，R2=0.999 7。亞油酸：y=1.040 0x+0.002 1，R2=0.999 6。α-亞麻酸：y=3.420 0x+0.001 5，R2=0.999 7。二十碳烯酸：y=6.920 0x+0.000 3，R2=0.999 7?？梢?，所有回歸線的相關(guān)系數(shù)R均大于0.99，證明線性良好。

2.3.2 范 圍

為了探究本方法對(duì)低質(zhì)量樣品的油脂和茶皂素提取率測(cè)定的準(zhǔn)確性，測(cè)定了從500 mg到10 mg樣品的油脂含量和茶皂素含量，含油率為（54.48±0.62）%，茶皂素含量為（9.52±0.42）%，由表5可以看出，樣品量為50 mg時(shí)，油脂和茶皂素的含量與真值的偏差均在方法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)，表明在此條件下能準(zhǔn)確測(cè)定其含量，因此，能準(zhǔn)確測(cè)定的樣品最低質(zhì)量不小于50 mg。

表3 油脂的回歸方差分析?Table 3 Regression variance analysis of Camellia oil

表4 茶皂素的回歸方差分析Table 4 Regression variance analysis of tea saponin

表5 樣品添加量的影響Table 5 Effect of sample addition

同時(shí)，為了探究最低質(zhì)量對(duì)不同樣品的有效性，選定了10例質(zhì)量約50 mg的不同油脂和茶皂素含量的樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定次數(shù)為6次，表中為6次測(cè)定的平均值。由表6可以看出，傳統(tǒng)經(jīng)典方法測(cè)定的種仁油脂提取率為26.37%～65.26%，茶皂素提取率為7.69%～11.51%；采用本文建立的方法測(cè)定種仁中的油脂和茶皂素的提取率，種仁油脂提取率為25.84%～64.51%，茶皂素提取率為7.91%～11.42%。通過研究本方法與傳統(tǒng)經(jīng)典方法測(cè)定值的關(guān)系，兩種方法的油脂提取率擬合曲線為y=0.976 8x，R2=0.998 9，兩種方法茶皂素提取率擬合曲線為y=1.000 6x，R2=0.974 5?？梢钥闯?，本方法油脂和茶皂素的測(cè)定值與傳統(tǒng)經(jīng)典方法的測(cè)定值具有很好的一致性，且對(duì)不同樣品具有較高的有效性。

表6 樣品含量差異的影響Table 6 Effect of sample varieties

2.3.3 精密度

油脂6次測(cè)定的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.34%，茶皂素6次測(cè)定的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.74%，均小于2.0%，表明該方法精密度高。

2.3.4 準(zhǔn)確度

平均加標(biāo)回收率（n=6）分別為：棕櫚酸100.07%、硬脂酸98.64%、油酸99.39%、亞油酸100.92%、α-亞麻酸97.13%、二十碳烯酸95.64%、茶皂素98.51%，可見各回收率均在98%～102%之間，表明該方法準(zhǔn)確度好。

2.4 油脂脂肪酸組成的測(cè)定

選擇了10例來自不同父本和母本的種仁樣品測(cè)定脂肪酸組成，結(jié)果見表7。由表7可以看出，茶油中主要成分為油酸，與已發(fā)表的文獻(xiàn)一致[15-17]，10例樣品中油酸的含量為79.181%～88.432%，其次為棕櫚酸和硬脂酸，這也與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的含量范圍基本接近[18-20]。本方法從測(cè)定的樣品中都檢測(cè)出α-亞麻酸，與文獻(xiàn)中報(bào)道的不是所有樣品都含有α-亞麻酸略有不同，說明參試的這些油茶良種具有別的品種所不具備的脂肪酸成分，為定向育種提供了品種資源和科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也說明了本方法也能有效提取種仁中的多不飽和脂肪酸。因此，本方法適用于油茶種仁油脂和茶皂素的同步測(cè)定，特別是質(zhì)量為半微量范圍內(nèi)的種仁，可為油茶優(yōu)良品種培育過程中需要研究單顆種子的油脂和茶皂素含量提供可靠的測(cè)定方法。

表7 樣品脂肪酸的組成Table 7 Fatty acid composition of the test sample

2.5 幾種方法的對(duì)比

比較了本文方法、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》（GB 5009.6—2016）方法（國標(biāo)法）、Folch提取法對(duì)油脂和茶皂素的提取和測(cè)定的特點(diǎn)，可以看出本方法可以同時(shí)快速提取并測(cè)定油脂和茶皂素的含量，結(jié)合氣相色譜法，還可以準(zhǔn)確測(cè)定脂肪酸組分，需要的樣品量為50 mg（表8）。國標(biāo)法雖能準(zhǔn)確測(cè)定油脂含量和脂肪酸組分，但樣品需要量大，為2 000～5 000 mg，測(cè)定時(shí)間在3種方法中為最長。Folch法與本文方法相比，雖然時(shí)間上稍長0.5 h，但在100 mg樣品量的條件下，F(xiàn)olch提取油脂的誤差值大于10%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于本文方法的1.34%的平均誤差。綜合來看，本文方法在半微量油茶種仁樣品的油脂和茶皂素含量測(cè)定上具有準(zhǔn)確度高、用時(shí)短、所需樣品量少等明顯優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

1）本研究建立了半微量油茶仁中油脂和茶皂素同步提取測(cè)定方法。第一步，油茶種仁機(jī)械破壁。稱取一定質(zhì)量干燥到恒質(zhì)量的油茶種仁，放入MM400冷凍混合球磨儀配套的鋼管中，同時(shí)加入3顆鋼珠，液氮冷卻到-20℃后，用冷凍混合球磨儀在10 000 r/min的條件下震蕩破碎2 min。第二步，油茶種仁油脂快速提取。按照一定料液比5∶1～30∶1 mL/g，在鋼管中分多次加入脂肪提取試劑盒，并將液體部分轉(zhuǎn)移到脂肪提取裝置中，加入0.2 mL質(zhì)量濃度為10 g/L的內(nèi)標(biāo)物(用油脂的提取溶劑配制)，提取油脂，冷凍離心機(jī)離心（10 000 r/min，5℃），取下層溶劑，揮發(fā)掉溶劑后得到油脂樣品，移取上層溶液用于茶皂素含量分析。第三步，油脂甲酯化。將油脂樣品按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》（GB 5009.6—2016）對(duì)油脂進(jìn)行甲酯化處理。第四步，油脂的GC-MS分析和數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)步驟和條件詳見1.3.5中的穩(wěn)定性驗(yàn)證。對(duì)脂肪酸甲酯混標(biāo)進(jìn)行采集，以單個(gè)脂肪酸甲酯的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以各種脂肪酸甲酯與十七碳酸甲酯的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸。在0.05～1.00 mg/L范圍內(nèi)，以單個(gè)脂肪酸甲酯的濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積與十七碳酸甲酯的峰面積的比值為橫縱坐標(biāo)作圖，得到單個(gè)脂肪酸的含量，進(jìn)而得到總的脂肪酸含量。第五步，茶皂素含量采用香草醛-硫酸顯色法結(jié)合外標(biāo)法測(cè)定，參照已有文獻(xiàn)執(zhí)行。

2）最佳綜合提取條件為：溫度31.35℃，時(shí)間10.41 min，料液比1∶21.9 g/mL，在此條件下，油脂和茶皂素的提取率分別為99.11%和97.73%。

3）本文方法通過線性、范圍、精密度、準(zhǔn)確度驗(yàn)證，所有回歸線的相關(guān)系數(shù)R均大于0.99，能準(zhǔn)確測(cè)定的樣品最低質(zhì)量不小于50 mg，油脂和茶皂素6次測(cè)定的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.34%和1.74%，平均加標(biāo)回收率（n=6）均在98%～102%范圍，表明本文方法的線性、范圍、精密度、準(zhǔn)確度各項(xiàng)指標(biāo)較好。

在種仁含油率26.37%～65.26%、茶皂素含量7.69 %～11.51 %的范圍內(nèi)，分別測(cè)定了10例50 mg油茶種仁樣品的油脂和茶皂素含量，發(fā)現(xiàn)本文方法與國標(biāo)法、Folch提取法比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4）在油脂提取的過程中，組分分為3層，包括油脂層、蛋白層和茶皂素層。油脂層的密度低，處于最上層，茶皂素層的密度高，處于最底層，蛋白層位于油脂層和茶皂素層的中間，占比很小。因此，油脂和茶皂素含量如需精準(zhǔn)測(cè)量，則取決于這兩種組分能很好分離。油茶種仁中的茶皂素是一種非離子型表面活性劑，HLB值為16，很難與油脂徹底分離。然而，少量的油脂即能對(duì)茶皂素的測(cè)定產(chǎn)生較大干擾。因此，油茶仁中油脂和茶皂素的同步提取測(cè)定難度很大。

5）本文采用脂肪提取試劑盒來測(cè)定種子、肉類和魚類樣本中的油脂含量，包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的油脂都能很好地提取，但對(duì)其它非脂質(zhì)組分的提取率很低，基于這種差異本文巧妙設(shè)計(jì)并建立起半微量油茶種仁油脂和茶皂素含量的同步提取測(cè)定方法。與傳統(tǒng)經(jīng)典方法比較，本文方法具有準(zhǔn)確度高、用時(shí)短、所需樣品量少等明顯優(yōu)勢(shì)，為油茶品質(zhì)研究和新品種培育提供了可靠分析方法和科學(xué)依據(jù)。