肖偉迪 董佳慧 孫耕耘

惡性胸腔積液(MPE)是晚期癌癥患者常見的并發(fā)癥，其中肺癌轉(zhuǎn)移后形成的胸腔積液最為常見，約占30%。肺癌轉(zhuǎn)移到胸膜，在最新的肺癌TNM分期系統(tǒng)中被定義為M1a(IVA期)，出現(xiàn)MPE意味著惡性腫瘤預(yù)后不良[1]?；颊咴谑状卧\斷為MPE后的生存期(OS)為3～12個(gè)月，不同的腫瘤亞型對患者生存期有著重要影響。一般來說，肺癌所致MPE患者的平均生存期為4～7個(gè)月，預(yù)后最差[2-3]。

早期、準(zhǔn)確地診斷MPE有助于改善患者的病情。然而，由于缺乏有效的篩查方法，MPE的診斷仍然具有挑戰(zhàn)性。臨床上常用的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手段包括生化、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子和細(xì)胞等參數(shù)的評估。胸腔積液中生物標(biāo)志物的定量檢測是其中重要的診斷方法，有助于病因的判斷。作為一種分泌蛋白，體液中可被檢測出的NGAL水平的升高已被證實(shí)與多種惡性腫瘤有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明NGAL可能是一種新的潛在的腫瘤生物標(biāo)志物。

資料與方法

一、研究對象

從2019年10月至2020年7月，98例未確診的胸腔積液患者被納入本研究，所有胸腔積液均通過病史、臨床表現(xiàn)、胸腔積液生化或細(xì)胞學(xué)、細(xì)菌學(xué)檢查、胸膜活檢、內(nèi)鏡檢查、經(jīng)皮穿刺活檢確診，未接受任何手術(shù)、放化療、射頻消融、靶向等治療。研究方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并根據(jù)赫爾辛基宣言的最新版本進(jìn)行。從醫(yī)療記錄和實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中提取臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

在98例患者中，44例有MPE，其中肺腺癌29例，肺鱗癌2例，肺小細(xì)胞癌4例，乳腺癌2例，淋巴瘤2例。其余5例MPE患者未發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌灶。以54例良性胸腔積液(BPE)為對照。其中包括結(jié)核性胸腔積液24例，肺旁胸腔積液22例，全身性疾病(漏出液)8例。

二、樣本的收集和分析

所有患者均接受標(biāo)準(zhǔn)胸腔穿刺術(shù)，在此期間收集胸腔積液樣品。將每個(gè)新鮮收集的胸腔積液樣品的一部分送至醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行CEA和CYFRA 21-1分析以及其他生化分析。將每個(gè)樣品的另一部分在3000 r/min離心15分鐘，并將上清液在-80℃儲存直到分析，避免重復(fù)凍融循環(huán)。在分析之前，樣品被重新離心以避免基質(zhì)效應(yīng)。

三、 NGAL和腫瘤標(biāo)志物的檢測

使用NGAL ELISA檢測試劑盒(Quantikine R&D，Minneapolis, USA)測定胸液NGAL水平，嚴(yán)格遵守制造商的說明。安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科使用電化學(xué)發(fā)光免疫法定量測定血清及胸液中CEA和CYFRA 21-1水平，還測量了血清及胸液細(xì)胞數(shù)、蛋白、蛋白、葡萄糖、乳酸脫氫酶(LDH)等水平。

四、統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 25.0(Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，偏態(tài)分布樣本數(shù)據(jù)通過中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(Q)來表示，兩個(gè)獨(dú)立樣本間使用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)評估組間差異的顯著性。采用Pearson相關(guān)系數(shù)(R)計(jì)算和線性回歸分析評估變量之間的關(guān)系。繪制ROC曲線和曲線下面積(AUC)，以評估胸液NGAL、CEA和CYFRA 21-1的總體診斷性能。此外，我們使用Creaney等[4]推薦的方法評估了兩個(gè)或三個(gè)標(biāo)記物共同區(qū)分MPE和BPE的能力。

結(jié) 果

一、患者的臨床特征

在該研究的98位患者中包括了44例MPE患者和54例非MPE患者，其中男性占63.27%(62/98)，女性占36.73%(36/98)，平均年齡為62.34歲。各組之間的年齡(P=0.563)，性別(P=0.317)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表1)列出了這98例患者的胸腔積液的病因。(表2)總結(jié)了所研究組的臨床特征以及主要實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，MPE組和BPE組在胸液顏色和外觀、血清CEA和CYFRA21-1、胸液白細(xì)胞計(jì)數(shù)等方面均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 胸腔積液患者的病因

二、胸液NGAL、CEA和CYFRA 21-1的含量及診斷價(jià)值

MPE患者胸液中NGAL，CEA和CYFRA 21-1的含量顯著高于BPE患者(表3)。使用ROC曲線評估每種標(biāo)記物的診斷性能(圖1，表4)。根據(jù)ROC曲線得出的診斷MPE的最佳截?cái)嘀担篘GAL為78.24 ng/ml, CEA為2.43ng/ml, CYFRA21-1為22.56 ng/ml。當(dāng)截?cái)嘀禐?8.24ng/ml時(shí)，NGAL診斷MPE的敏感度為61.36%，特異度為74.07%，AUC為0.71。CEA顯示最佳診斷性能，AUC為0.82。

表2 MPE組和BPE組血液、胸液標(biāo)本的特征

表3 胸液中NGAL、CEA、CYFRA21-1的含量

我們還研究了MPE標(biāo)記物不同組合的診斷性能(表4)。胸液CEA和NGAL組合對惡性胸腔積液診斷的敏感度為84.09%，特異度為70.37%，準(zhǔn)確度為76.53%，AUC為0.84(圖1)。常規(guī)腫瘤標(biāo)記物CEA和CYFRA 21-1組合的敏感度為65.91% ，特異度為85.96%，AUC為0.85；三種標(biāo)記物的組合AUC為 0.86，具有最高的特異度88.89%。

圖1 評估胸液NGAL、CEA、CYFRA21-1診斷價(jià)值的ROC曲線

表4 胸液NGAL、CEA 、CYFRA21-1診斷價(jià)值(%)

討 論

胸腔積液是惡性腫瘤最常見的并發(fā)癥之一[5]，早期、準(zhǔn)確地診斷MPE可提高識別原發(fā)性惡性腫瘤的能力，并盡快開始治療[6]。但是，目前的檢測方法對MPE診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性不高。現(xiàn)有研究表明，NGAL在多種惡性腫瘤的組織及體液中呈高表達(dá)，其升高可能與惡性胸腔積液有關(guān)[7]。目前在MPE中關(guān)于NGAL水平的研究較少，因此本研究開展了相關(guān)檢測試驗(yàn)，研究重點(diǎn)在于評判NGAL水平與MPE的相關(guān)性是否足夠強(qiáng)，NGAL是否足以用作MPE的診斷性生物標(biāo)志物。

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)，又名LCN2或24p3，是一種分泌性糖蛋白，由178個(gè)氨基酸殘基組成。在正常生物體中，NGAL主要在中性粒細(xì)胞中表達(dá)，在巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中也存在低穩(wěn)態(tài)水平的NGAL[8]。目前的研究已經(jīng)將NGAL與癌癥的發(fā)展和進(jìn)展聯(lián)系起來[9]，NGAL有利于腫瘤細(xì)胞的增殖與存活，在肺癌中，NGAL可能通過激活核因子E2相關(guān)因子2 /血紅素加氧酶-1(Nrf2 / HO-1)途徑并誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1和超氧化物歧化酶1的表達(dá)來防御氧化應(yīng)激[10]，此外，NGAL還通過與特異性結(jié)合受體24p3R結(jié)合，增加細(xì)胞內(nèi)鐵濃度，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[11]。NGAL的致癌作用還可能與NGAL/MMP-9復(fù)合物有關(guān)，NGAL/MMP-9對MMP-9的自我降解具有保護(hù)作用，從而使MMP-9在細(xì)胞外基質(zhì)中具有較高的明膠溶解作用[12]。由于這一功能，NGAL可能促進(jìn)癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。最近的研究表明，在大多數(shù)癌癥類型中，高濃度的NGAL與疾病嚴(yán)重程度和低存活率有關(guān)[13-14]。

現(xiàn)有的少數(shù)關(guān)于胸腔積液中NGAL診斷效能的報(bào)道存在爭議。Gümüs等[15]首次在胸腔積液中檢測NGAL，指出血清和胸液NGAL水平可區(qū)別PPE(肺炎旁胸腔積液)與其他導(dǎo)致胸腔積液的原因(如心力衰竭、MPE和結(jié)核病)。血清NGAL水平比胸液NGAL水平具有更高的診斷價(jià)值，高于188 ng/mL的血清NGAL水平和高于210 ng/mL的胸液NGAL水平在區(qū)分PPE患者和非PPE患者方面非常有效(AUC分別為0.910和0.790)。Wu等[16]的研究報(bào)道，截?cái)嘀禐?69.9 ng/mL時(shí)，胸液NGAL對PPE診斷的敏感度高達(dá)92.6%，AUC為0.983，他們進(jìn)一步應(yīng)用NGAL鑒別復(fù)雜性(CPPE)和非復(fù)雜性肺炎旁積液(UPPE)，并發(fā)現(xiàn)CPPE中胸液NGAL水平明顯高于UPPE(P<0.001)。與上述研究結(jié)論不同的是，最近的一項(xiàng)在圣保羅大學(xué)醫(yī)院進(jìn)行的回顧性研究顯示[7]，惡性積液(malignant effusion,ME)的NGAL濃度顯著高于非結(jié)核性感染性胸腔積液(nontuberculous infectious effusion,NTBIE)、結(jié)核性胸腔積液(TPE)和漏出液(TRANS)，NGAL診斷ME的敏感度、特異度分別為76.1%、77.5%，ACU為75.8%。

本研究觀察到MPE患者的胸液NGAL水平高于BPE患者，當(dāng)與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物(如CEA和CYFRA 21-1)結(jié)合使用時(shí)，NGAL有助于MPE的診斷。NGAL本身對診斷MPE具有較低的敏感度(61.36%)和特異度(74.07%)，但聯(lián)合CEA具有較高的敏感度(84.09%)及診斷價(jià)值(AUC=0.84)。依據(jù)本研究結(jié)果，將NGAL與常規(guī)標(biāo)志物(如CEA和CYFRA 21-1)結(jié)合使用可能更適合診斷MPE，這一初步發(fā)現(xiàn)支持運(yùn)用多種生物標(biāo)志物的組合以提高臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究還比較了患有原發(fā)性支氣管肺癌(n=35)及其他類型惡性腫瘤(n=9)患者，未發(fā)現(xiàn)胸液中NGAL含量有顯著差異，此結(jié)果需在具有多中心的較大樣本中進(jìn)一步證實(shí)。有證據(jù)表明，患有不同類型癌癥的癌癥患者血清中NGAL水平，可能有所不同[13, 17-19]。因此，進(jìn)一步的研究擬收集多種類型腫瘤患者標(biāo)本，分析NGAL對于不同癌癥相關(guān)MPE的鑒別是否有用。

由于我們的研究納入的MPE患者有限(n=44)，樣本中未涵蓋間皮瘤和其他轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的病例，NGAL水平是否與所有MPE病例相關(guān)尚未明確。因此，進(jìn)一步的研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量、增加分組，進(jìn)一步評估其診斷價(jià)值。

結(jié) 論

胸液NGAL水平升高與MPE有關(guān)。NGAL與經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物(CEA和CYFRA 21-1)聯(lián)合使用有助于提高現(xiàn)有手段對MPE診斷的能力，具有一定的臨床指導(dǎo)意義，未來仍需在更大更嚴(yán)格的研究中得到驗(yàn)證和擴(kuò)展。