朱亮華 袁文霄 金蕊

哮喘是一種慢性呼吸道疾病，全球發(fā)病率逐年增高，特別是兒童[1]，其發(fā)病有多基因參與[2]。喘息是嬰幼兒多見的呼吸道癥狀，部分哮喘是由反復(fù)喘息發(fā)展而成的，兩者關(guān)系密切[3]。與兒童哮喘起病最密切相關(guān)的易感基因是ORMDL3，它通過調(diào)節(jié)鞘脂類的合成、T淋巴細(xì)胞活化和誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與哮喘的發(fā)病[4-6]。目前，發(fā)現(xiàn)了ORMDL3的一些剪接異構(gòu)體。我們查找了在GENEBANK上發(fā)表的ORMDL3的剪接異構(gòu)體(AK093063.1)，我們定義為ORMDL3-v1，該剪接異構(gòu)體是在睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的。為了了解這個剪接異構(gòu)體與反復(fù)喘息的關(guān)系，本研究首先在反復(fù)喘息患兒外周血中通過5′-RACE實(shí)驗(yàn)，鑒定了這個剪接異構(gòu)體的存在，隨后檢測了反復(fù)喘息患兒ORMDL3-v1及其野生型ORMDL3的表達(dá)水平，探討其在兒童反復(fù)喘息中的作用。

資料與方法

一、臨床資料

選取2017年06月至2019年06月在我院兒科住院的小于5歲的反復(fù)喘息患兒48例，其中特應(yīng)性喘息A組(喘息A組)28例(其中至少有對食物或藥物過敏，變應(yīng)性鼻炎和濕疹之一)，非特應(yīng)性喘息B組(喘息B組)20例。反復(fù)喘息定義為生后至少3次及以上喘息發(fā)作，并排除早產(chǎn)、重癥肺炎和支氣管異物等病史。4周內(nèi)無呼吸道感染及特應(yīng)性病史的為正常對照組(32例)，收集外周血檢測。我院倫理委員會批準(zhǔn)了該項(xiàng)目[(2008)倫審第(1102)號]，患兒父母均簽署知情同意書。

二、材料

pMD18-T載體、RT-PCR和5′ RACE試劑盒(TaKaRa，大連)，感受態(tài)大腸桿菌 DH5α(QIAGEN，德國)。

三、方法

1 5′ RACE實(shí)驗(yàn)

收集一例反復(fù)喘息兒童(喘息A組中的一例)外周血250 ul(第一天入院)，按照工具包手冊中描述的步驟提取總RNA。primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列(見表1)，按試劑盒的操作步驟進(jìn)行，PCR產(chǎn)物切膠回收。

表1 各個基因引物序列

2 T-A 克隆及測序

pMD18-T 1ul、產(chǎn)物1ul、水3ul、Solution I 5ul，16℃ 30 min，加入100ul DH5α，冰中30 min，42℃45 Sec ，冰中1 min。加入 890 ul培養(yǎng)基，37℃60 min。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選白色菌落，送上海英駿生物公司測序。

3 模板cDNA的制備

收集反復(fù)喘息組和正常對照組兒童外周血250 ul(第一天入院)，提取總RNA，然后將cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成保持在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

4 設(shè)計(jì)合成引物

primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物 ，引物合成由上海英駿生物有限公司完成。

5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

反應(yīng)條件如下： 94°C 5min，94°C 1 min，59.6°C 30 s，72°C 30 s，ORMDL3 36個循環(huán)，ORMDL3-v1 34個循環(huán)，28個GAPDH 循環(huán)。在1.5%瓊脂凝膠上采用5ul PCR產(chǎn)物電泳，在溴化乙啶顯色后觀察紫外線散射器下的條帶，并使用圖像分析軟件Pro Plus分析平均灰度值。mRNA表達(dá)以目標(biāo)基因/ GAPDH的灰度表示。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、 ORMDL3-v1的鑒定

從ORMDL3-v1第1外顯子中設(shè)計(jì)二條反義引物，用來自反復(fù)喘息兒童外周血的總RNA為模板，擴(kuò)增出1個約300 bp的條帶(圖1)。將產(chǎn)物連接T載體，隨機(jī)挑選5個克隆測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中ORMDL3序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，RACE產(chǎn)物的序列與ORMDL3的剪接異構(gòu)體(AK093063.1)的序列相比，5個克隆中有1個序列與ORMDL3-v1序列完全一致，另4個缺失轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后2～8bp長度的序列，余與ORMDL3-v1序列一致。

圖1 反復(fù)喘息兒童外周血RNA行 5′-RACE產(chǎn)物電泳圖

二、 各組病例臨床資料分析

喘息A組的年齡為(8～55)月，平均年齡(26.78 ±13.19)月，喘息B組的年齡為(8～52)月，平均年齡(24.80 ±13.19)月，正常對照組為(6～46)月，平均(24.84 ±12.13)月；在喘息A組和喘息B組中，男孩構(gòu)成比明顯大于女孩(男:女分別為21:7和13:7)，正常對照組為18:14；在喘息組(共48例)中，1～3月發(fā)作6例(13%)，4～6月發(fā)作14例(29%)，有8例7～9月發(fā)病，占17%，20例10～12月發(fā)病，占41%。

箭頭代表產(chǎn)物條帶。 M: DL2000 marker; RACE: PCR 產(chǎn)物。

三、3組兒童ORMDL3-v1和ORMDL3基因的表達(dá)水平比較

3組兒童ORMDL3-v1的表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.26，P<0.001)。正常對照組ORMDL3-v1的表達(dá)水平顯著低于2個喘息組(LSD-t=5.06、2.87，P<0.01)，ORMDL3-v1的表達(dá)在A組和B組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(LSD-t=1.43，P>0.05)。3組兒童ORMDL3的表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=76.39，P<0.001)。2個喘息組ORMDL3的表達(dá)顯著高于正常對照組(LSD-t=11.57、9.28，P<0.01)， 喘息B組ORMDL3的表達(dá)水平明顯低于A組 (LSD-t=4.01，P<0.01)(見表2)。

表2 正常對照組和各喘息組ORMDL3-v1和ORMDL3表達(dá)水平的差異

四、 3組兒童ORMDL3-v1/ORMDL3比值比較

3組兒童ORMDL3-v1/ORMDL3的比值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=8.17，P<0.001)。喘息A組ORMDL3-v1/ORMDL3的比值與喘息B組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，正常對照組ORMDL3-v1/ORMDL3的比值高于喘息A組(P<0.01)和喘息B組(P<0.05)(見表3)。

表3 正常對照組和各喘息組ORMDL3-v1/ORMDL3比值的差異

討 論

研究表明，哮喘和反復(fù)喘息發(fā)病的最直接原因是基因-環(huán)境交互作用。ORMDL3基因是2007年Nature雜志發(fā)表的，用全基因組關(guān)聯(lián)研究方法鑒定的首個兒童哮喘易感基因[3]。有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控該基因表達(dá)的單核苷酸多態(tài)性與用現(xiàn)有治療藥物仍控制不佳的哮喘密切相關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)在哮喘和反復(fù)喘息患兒的外周血中[8-9]、過敏原刺激哮喘小鼠模型[10]和家塵螨過敏原Der p 1刺激臍血單核細(xì)胞，ORMDL3的核糖核酸表達(dá)水平顯著高于對照組[11]。在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中，mRNA的基因前體可以通過選擇不同的剪切位置，將mRNA的不同剪切異構(gòu)體組合在一起，這一過程被稱為可變剪切。40%～60%的人類基因有剪接異構(gòu)體，它是擴(kuò)大蛋白質(zhì)多樣性的重要的機(jī)制之一[12]。目前關(guān)于ORMDL3基因的剪接異構(gòu)體的研究相對較少。GENEBANK上發(fā)表的ORMDL3剪接異構(gòu)體(AK093063.1)是在人睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的，我們定義為ORMDL3-v1， 它的外顯子有6個，第一至第三個位于野生型ORMDL3基因的第一個內(nèi)含子內(nèi)。第4～6外顯子與野生型第2～4外顯子相同。目前關(guān)于它是否在反復(fù)喘息中表達(dá)及表達(dá)水平如何，我們均不清楚。

本研究中我們首先通過研究剪接異構(gòu)體的常用實(shí)驗(yàn)5′ RACE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測序比對后發(fā)現(xiàn)5個克隆中有1個序列與ORMDL3-v1序列完全一致，另4個缺失轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后2～8bp長度的序列，余與ORMDL3-v1序列一致。說明該剪接異構(gòu)體在反復(fù)喘息患兒外周血中有表達(dá)。然后我們收集了5歲以下反復(fù)喘息患兒和正常對照兒童的外周血，檢測了剪接異構(gòu)體ORMDL3-v1 及其野生型ORMDL3 mRNA的表達(dá)水平，并計(jì)算了ORMDL3-v1/ORMDL3的比值。結(jié)果顯示： ORMDL3-v1及ORMDL3基因表達(dá)水平在正常對照組均低于喘息A組和B組，喘息B組ORMDL3表達(dá)水平低于A組，但喘息A組ORMDL3-v1表達(dá)水平與喘息B組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。喘息A組ORMDL3-v1/ORMDL3的比值與喘息B組無差異，二者均低于正常對照組。我們課題組前期的研究，檢測了小于3歲反復(fù)喘息兒童ORMDL3的表達(dá)水平[13]，此次研究擴(kuò)大了年齡范圍(小于5歲)，主要檢測了ORMDL3-v1這個剪接異構(gòu)體的表達(dá)并分析了ORMDL3-v1/ORMDL3的比值在反復(fù)喘息中的意義。 說明在反復(fù)喘息的發(fā)病中ORMDL3-v1和ORMDL3可能都參與了，但二者可能在功能上存在一定的差異。有研究證實(shí)多數(shù)基因的剪接異構(gòu)體對野生型具有負(fù)調(diào)控作用[14]，而我們的研究也發(fā)現(xiàn)ORMDL3-v1/ORMDL3的比值在正常對照組中高于反復(fù)喘息組，說明ORMDL3-v1這個剪接異構(gòu)體在反復(fù)喘息中的作用，可能也是對ORMDL3有負(fù)調(diào)控的作用。

我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在HeLa細(xì)胞中，通過5′- cDNA末端快速擴(kuò)增法和3′-cDNA末端快速擴(kuò)增法實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了一種新的ORMDL3基因的異構(gòu)體。與野生型ORMDL3相比，第二外顯子缺失，并且有不同長度的 3′-非翻譯區(qū)，編碼一個氨基端截短59個氨基酸的蛋白質(zhì)[15]。我們檢測了它的表達(dá)，在反復(fù)喘息和正常兒童的外周血中，未見該剪接異構(gòu)體的表達(dá)。說明一個基因不同的剪接異構(gòu)體有不同的功能，在多種組織和細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用。

綜上所述，ORMDL3和它的剪接異構(gòu)體ORMDL3-v1可能通過不同的作用，參與了反復(fù)喘息的發(fā)病。后續(xù)我們可進(jìn)一步研究該剪接異構(gòu)體的功能及其與哮喘及反復(fù)喘息治療和預(yù)后的關(guān)系等。ORMDL3和 ORMDL3-v1的表達(dá)水平可能有望作為實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)，用于指導(dǎo)臨床診斷及評價治療效果。