朱亮華 袁文霄 金蕊

哮喘是一種慢性呼吸道疾病，全球發(fā)病率逐年增高，特別是兒童[1]，其發(fā)病有多基因參與[2]。喘息是嬰幼兒多見的呼吸道癥狀，部分哮喘是由反復喘息發(fā)展而成的，兩者關系密切[3]。與兒童哮喘起病最密切相關的易感基因是ORMDL3，它通過調(diào)節(jié)鞘脂類的合成、T淋巴細胞活化和誘導產(chǎn)生多種細胞因子參與哮喘的發(fā)病[4-6]。目前，發(fā)現(xiàn)了ORMDL3的一些剪接異構體。我們查找了在GENEBANK上發(fā)表的ORMDL3的剪接異構體(AK093063.1)，我們定義為ORMDL3-v1，該剪接異構體是在睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的。為了了解這個剪接異構體與反復喘息的關系，本研究首先在反復喘息患兒外周血中通過5′-RACE實驗，鑒定了這個剪接異構體的存在，隨后檢測了反復喘息患兒ORMDL3-v1及其野生型ORMDL3的表達水平，探討其在兒童反復喘息中的作用。

資料與方法

一、臨床資料

選取2017年06月至2019年06月在我院兒科住院的小于5歲的反復喘息患兒48例，其中特應性喘息A組(喘息A組)28例(其中至少有對食物或藥物過敏，變應性鼻炎和濕疹之一)，非特應性喘息B組(喘息B組)20例。反復喘息定義為生后至少3次及以上喘息發(fā)作，并排除早產(chǎn)、重癥肺炎和支氣管異物等病史。4周內(nèi)無呼吸道感染及特應性病史的為正常對照組(32例)，收集外周血檢測。我院倫理委員會批準了該項目[(2008)倫審第(1102)號]，患兒父母均簽署知情同意書。

二、材料

pMD18-T載體、RT-PCR和5′ RACE試劑盒(TaKaRa，大連)，感受態(tài)大腸桿菌 DH5α(QIAGEN，德國)。

三、方法

1 5′ RACE實驗

收集一例反復喘息兒童(喘息A組中的一例)外周血250 ul(第一天入院)，按照工具包手冊中描述的步驟提取總RNA。primer 5.0設計引物，引物序列(見表1)，按試劑盒的操作步驟進行，PCR產(chǎn)物切膠回收。

表1 各個基因引物序列

2 T-A 克隆及測序

pMD18-T 1ul、產(chǎn)物1ul、水3ul、Solution I 5ul，16℃ 30 min，加入100ul DH5α，冰中30 min，42℃45 Sec ，冰中1 min。加入 890 ul培養(yǎng)基，37℃60 min。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選白色菌落，送上海英駿生物公司測序。

3 模板cDNA的制備

收集反復喘息組和正常對照組兒童外周血250 ul(第一天入院)，提取總RNA，然后將cDNA逆轉錄合成保持在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

4 設計合成引物

primer 5.0軟件設計引物 ，引物合成由上海英駿生物有限公司完成。

5 逆轉錄聚合酶鏈反應

反應條件如下： 94°C 5min，94°C 1 min，59.6°C 30 s，72°C 30 s，ORMDL3 36個循環(huán)，ORMDL3-v1 34個循環(huán)，28個GAPDH 循環(huán)。在1.5%瓊脂凝膠上采用5ul PCR產(chǎn)物電泳，在溴化乙啶顯色后觀察紫外線散射器下的條帶，并使用圖像分析軟件Pro Plus分析平均灰度值。mRNA表達以目標基因/ GAPDH的灰度表示。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、 ORMDL3-v1的鑒定

從ORMDL3-v1第1外顯子中設計二條反義引物，用來自反復喘息兒童外周血的總RNA為模板，擴增出1個約300 bp的條帶(圖1)。將產(chǎn)物連接T載體，隨機挑選5個克隆測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中ORMDL3序列進行比對發(fā)現(xiàn)，RACE產(chǎn)物的序列與ORMDL3的剪接異構體(AK093063.1)的序列相比，5個克隆中有1個序列與ORMDL3-v1序列完全一致，另4個缺失轉錄起始位點后2～8bp長度的序列，余與ORMDL3-v1序列一致。

圖1 反復喘息兒童外周血RNA行 5′-RACE產(chǎn)物電泳圖

二、 各組病例臨床資料分析

喘息A組的年齡為(8～55)月，平均年齡(26.78 ±13.19)月，喘息B組的年齡為(8～52)月，平均年齡(24.80 ±13.19)月，正常對照組為(6～46)月，平均(24.84 ±12.13)月；在喘息A組和喘息B組中，男孩構成比明顯大于女孩(男:女分別為21:7和13:7)，正常對照組為18:14；在喘息組(共48例)中，1～3月發(fā)作6例(13%)，4～6月發(fā)作14例(29%)，有8例7～9月發(fā)病，占17%，20例10～12月發(fā)病，占41%。

箭頭代表產(chǎn)物條帶。 M: DL2000 marker; RACE: PCR 產(chǎn)物。

三、3組兒童ORMDL3-v1和ORMDL3基因的表達水平比較

3組兒童ORMDL3-v1的表達水平有統(tǒng)計學差異(F=11.26，P<0.001)。正常對照組ORMDL3-v1的表達水平顯著低于2個喘息組(LSD-t=5.06、2.87，P<0.01)，ORMDL3-v1的表達在A組和B組之間無統(tǒng)計學差異(LSD-t=1.43，P>0.05)。3組兒童ORMDL3的表達水平有統(tǒng)計學差異(F=76.39，P<0.001)。2個喘息組ORMDL3的表達顯著高于正常對照組(LSD-t=11.57、9.28，P<0.01)， 喘息B組ORMDL3的表達水平明顯低于A組 (LSD-t=4.01，P<0.01)(見表2)。

表2 正常對照組和各喘息組ORMDL3-v1和ORMDL3表達水平的差異

四、 3組兒童ORMDL3-v1/ORMDL3比值比較

3組兒童ORMDL3-v1/ORMDL3的比值有統(tǒng)計學差異(F=8.17，P<0.001)。喘息A組ORMDL3-v1/ORMDL3的比值與喘息B組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，正常對照組ORMDL3-v1/ORMDL3的比值高于喘息A組(P<0.01)和喘息B組(P<0.05)(見表3)。

表3 正常對照組和各喘息組ORMDL3-v1/ORMDL3比值的差異

討 論

研究表明，哮喘和反復喘息發(fā)病的最直接原因是基因-環(huán)境交互作用。ORMDL3基因是2007年Nature雜志發(fā)表的，用全基因組關聯(lián)研究方法鑒定的首個兒童哮喘易感基因[3]。有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控該基因表達的單核苷酸多態(tài)性與用現(xiàn)有治療藥物仍控制不佳的哮喘密切相關[7]。研究發(fā)現(xiàn)在哮喘和反復喘息患兒的外周血中[8-9]、過敏原刺激哮喘小鼠模型[10]和家塵螨過敏原Der p 1刺激臍血單核細胞，ORMDL3的核糖核酸表達水平顯著高于對照組[11]。在基因轉錄和翻譯過程中，mRNA的基因前體可以通過選擇不同的剪切位置，將mRNA的不同剪切異構體組合在一起，這一過程被稱為可變剪切。40%～60%的人類基因有剪接異構體，它是擴大蛋白質多樣性的重要的機制之一[12]。目前關于ORMDL3基因的剪接異構體的研究相對較少。GENEBANK上發(fā)表的ORMDL3剪接異構體(AK093063.1)是在人睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的，我們定義為ORMDL3-v1， 它的外顯子有6個，第一至第三個位于野生型ORMDL3基因的第一個內(nèi)含子內(nèi)。第4～6外顯子與野生型第2～4外顯子相同。目前關于它是否在反復喘息中表達及表達水平如何，我們均不清楚。

本研究中我們首先通過研究剪接異構體的常用實驗5′ RACE實驗進行測序比對后發(fā)現(xiàn)5個克隆中有1個序列與ORMDL3-v1序列完全一致，另4個缺失轉錄起始位點后2～8bp長度的序列，余與ORMDL3-v1序列一致。說明該剪接異構體在反復喘息患兒外周血中有表達。然后我們收集了5歲以下反復喘息患兒和正常對照兒童的外周血，檢測了剪接異構體ORMDL3-v1 及其野生型ORMDL3 mRNA的表達水平，并計算了ORMDL3-v1/ORMDL3的比值。結果顯示： ORMDL3-v1及ORMDL3基因表達水平在正常對照組均低于喘息A組和B組，喘息B組ORMDL3表達水平低于A組，但喘息A組ORMDL3-v1表達水平與喘息B組無統(tǒng)計學差異。喘息A組ORMDL3-v1/ORMDL3的比值與喘息B組無差異，二者均低于正常對照組。我們課題組前期的研究，檢測了小于3歲反復喘息兒童ORMDL3的表達水平[13]，此次研究擴大了年齡范圍(小于5歲)，主要檢測了ORMDL3-v1這個剪接異構體的表達并分析了ORMDL3-v1/ORMDL3的比值在反復喘息中的意義。 說明在反復喘息的發(fā)病中ORMDL3-v1和ORMDL3可能都參與了，但二者可能在功能上存在一定的差異。有研究證實多數(shù)基因的剪接異構體對野生型具有負調(diào)控作用[14]，而我們的研究也發(fā)現(xiàn)ORMDL3-v1/ORMDL3的比值在正常對照組中高于反復喘息組，說明ORMDL3-v1這個剪接異構體在反復喘息中的作用，可能也是對ORMDL3有負調(diào)控的作用。

我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在HeLa細胞中，通過5′- cDNA末端快速擴增法和3′-cDNA末端快速擴增法實驗，發(fā)現(xiàn)了一種新的ORMDL3基因的異構體。與野生型ORMDL3相比，第二外顯子缺失，并且有不同長度的 3′-非翻譯區(qū)，編碼一個氨基端截短59個氨基酸的蛋白質[15]。我們檢測了它的表達，在反復喘息和正常兒童的外周血中，未見該剪接異構體的表達。說明一個基因不同的剪接異構體有不同的功能，在多種組織和細胞中發(fā)揮不同的作用。

綜上所述，ORMDL3和它的剪接異構體ORMDL3-v1可能通過不同的作用，參與了反復喘息的發(fā)病。后續(xù)我們可進一步研究該剪接異構體的功能及其與哮喘及反復喘息治療和預后的關系等。ORMDL3和 ORMDL3-v1的表達水平可能有望作為實驗室檢測指標，用于指導臨床診斷及評價治療效果。