王美君?梁日英?徐芬?梁小奇?李綺芊?蔡夢茵

【摘要】目的 探討恩格列凈改善人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）凋亡的機(jī)制。方法 將HK-2細(xì)胞置于正常葡萄糖、高葡萄糖、高葡萄糖+不同濃度的恩格列凈共干預(yù)環(huán)境下培養(yǎng)48 h。采用蛋白免疫印跡法檢測腎臟沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）、硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）以及裂解的半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3）的表達(dá)水平。采用TUNEL染色評估HK-2細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，高葡萄糖培養(yǎng)48 h后HK-2細(xì)胞的TXNIP和cleaved Caspase-3表達(dá)水平均高于正常葡萄糖組，而SIRT1表達(dá)水平低于正常葡萄糖組（P均< 0.05）。1000 nmol/L恩格列凈和30 mmol/L葡萄糖共干預(yù)48 h后，HK-2細(xì)胞的TXNIP和cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平降低，SIRT1表達(dá)水平升高（P均< 0.001）。TUNEL染色結(jié)果顯示恩格列凈和30 mmol/L葡萄糖共干預(yù)組較30 mmol/L葡萄糖組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)少，且1000 nmol/L恩格列凈和30 mmol/L葡萄糖共干預(yù)組凋亡改善更明顯。結(jié)論 恩格列凈可能通過上調(diào)SIRT1的表達(dá)、抑制TXNIP表達(dá)，改善高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】恩格列凈;沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1;硫氧還蛋白互作蛋白;

糖尿病腎臟疾病;人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞

Mechanism of empagliflozin in mitigating HK-2 cells apoptosis induced by high glucose Wang Meijun， Liang Riying， Xu Fen， Liang Xiaoqi， Li Qiqian， Cai Mengyin. Department of Endocrinology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Cai Mengyin， E-mail： caimengyin@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the mechanism of empagliflozin in mitigating the apoptosis of human renal proximal tubule epithelial cells （HK-2 cells）. Methods HK-2 cells were incubated in normal glucose （NG） or high glucose （HG） combined without or with empagliflozin at different concentrations for 48 h. The expression levels of silent mating type information regulation 2 homolog 1（SIRT1）， thioredoxin-interacting protein （TXNIP） and cleaved Caspase-3 were determined by Western blot. The apoptosis of HK-2 cells was determined by TUNEL staining. Results Western blot demonstrated that the expression levels of TXNIP and cleaved Caspase-3 at 48 h in the HG group were significantly higher， whereas that of SIRT1 was remarkably lower compared with those in the NG group （all P < 0.05）. After combined interventions of 1000 nmol/L empagliflozin and 30 mmol/L glucose for 48 h， the expression levels of TXNIP and cleaved Caspase-3 were significantly down-regulated， whereas that of SIRT1 was considerably up-regulated （all P < 0.001）.TUNEL staining demonstrated that the number of TUNEL-positive cells in the empagliflozin combined with 30 mmol/L

glucose group was significantly less than that in the 30 mmol/L glucose group. In the 1000 nmol/L combined with 30 mmol/L glucose group， the cell apoptosis was more evident. Conclusion Empagliflozin can protect HK-2 cells from HG-mediated apoptosis probably by up-regulating the expression level of SIRT1 protein and down-regulating that of TXNIP protein.

【Key words】Empagliflozin;SIRT1;TXNIP;Diabetic kidney disease;

Human renal proximal tubule epithelial cells

中國 2型糖尿?。═2DM）患者中腎病患病率高達(dá) 30% ～ 50%，白蛋白尿和腎小球濾過率受損的患者10 年累積病死率達(dá)47%，給社會帶來極大的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。強(qiáng)化降糖、降壓、ARB/ACEI雖可降低蛋白尿風(fēng)險，但仍缺乏腎臟硬終點(diǎn)獲益的證據(jù)。恩格列凈心血管結(jié)局事件試驗（EMPA-REG OUTCOME）研究顯示恩格列凈治療組血清肌酐水平增加1倍的相對風(fēng)險顯著降低44%、采用腎臟替代療法較安慰劑組的相對風(fēng)險降低了55%[2-3]。鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SGLT2）抑制劑可改善腎小球血流動力學(xué)、腎小管能量代謝和腎臟疾病高危因素等，延緩糖尿病腎病的進(jìn)展，但目前還不能完全解釋其腎臟保護(hù)機(jī)制。

2014年美國糖尿病協(xié)會（ADA）棄用糖尿病腎病名稱，改為糖尿病腎臟疾?。―KD），說明糖尿病腎功能損傷不僅僅與腎小球病變相關(guān)。據(jù)報道，腎小管變化與腎功能損傷緊密相關(guān)，比腎小球變化更能準(zhǔn)確預(yù)測DKD的進(jìn)展[4-5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）可調(diào)節(jié)特定賴氨酸殘基上的組蛋白，促進(jìn)翻譯后修飾，從而導(dǎo)致染色質(zhì)沉默和轉(zhuǎn)錄抑制[6]。激活SIRT1可改善部分代謝參數(shù)，如糖耐量、空腹血糖水平和胰島素抵抗，從而延長動物壽命[7]。SIRT1除了對代謝有益外，在DKD中還具有抑制足細(xì)胞和小管細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[8-9]。很多研究已證實(shí)SIRT1與改善高糖誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡效應(yīng)有關(guān)[10-11]。

基因芯片技術(shù)研究顯示硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）是高糖調(diào)節(jié)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）基因中最顯著增加的基因，是葡萄糖毒性和細(xì)胞損傷之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提示抑制該蛋白可在DKD中發(fā)揮重要作用[12]。此外，敲除TXNIP基因已被證實(shí)可以限制系膜細(xì)胞和近端小管細(xì)胞葡萄糖誘導(dǎo)的膠原生成和氧化應(yīng)激[12-13]。

有研究者用高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞和小鼠腎臟組織 TXNIP 基因的乙酰化修飾上調(diào)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TXNIP與小鼠的DKD相關(guān)[14]。這表明抑制TXNIP可能是一種治療DKD的新方法。本研究組旨在探討恩格列凈改善高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的作用以及SIRT1、TXNIP在其中的可能機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗材料

DMEM No Glucose培養(yǎng)基、Hams F-12 Nutrient

Mixture、澳洲胎牛血清 FBS QUALIFIED AUSTRALIA

ORIGIN購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。葡萄糖粉末購自Sigma-Aldrich公司。恩格列凈購自Selleck生物科技有限公司。RIPA Lysis and Extraction Buffer、Halt? Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail購自美國Thermo Scientific公司。SIRT1抗體購自美國Merck Millipore公司。TXNIP抗體和裂解的半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3）抗體購自CST公司。TUNEL試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，F(xiàn)luorescein）購自Roche公司。HK-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

二、實(shí)驗方法

1. HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)和分組

單純給予不同濃度葡萄糖干預(yù)：取HK-2細(xì)胞種植于6孔板中分為3組并饑餓24 h，然后分別用5.5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖或50 mmol/L葡萄糖干預(yù)48 h，探討不同葡萄糖濃度對HK-2細(xì)胞SIRT1和TXNIP表達(dá)的影響。

給予30 mmol/L葡萄糖干預(yù)0、12、24 h：取HK-2細(xì)胞種植于6孔板中并饑餓24 h，然后用30 mmol/L葡萄糖干預(yù)0、12、24 h，探討30 mmol/L

葡萄糖在不同時間對HK-2細(xì)胞SIRT1和TXNIP表達(dá)的影響。

前2組僅單純給予葡萄糖干預(yù)，后3組給予不同濃度恩格列凈+高葡萄糖處理：取HK-2細(xì)胞種植于6孔板中分為5組并饑餓24 h，然后用5.5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖或用分別添加了250 nmol/L、500 nmol/L或1000 nmol/L恩格列凈工作液的30 mmol/L葡萄糖共干預(yù)48 h。

2.蛋白免疫印跡法檢測HK-2細(xì)胞各組蛋白相對表達(dá)水平

提取各組細(xì)胞蛋白，采用蛋白免疫印跡法檢測SIRT1、TXNIP和cleaved Caspase-3等蛋白的相對表達(dá)情況。

3.TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡

將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)在裝有細(xì)胞爬片的24孔板中并分為5組，正常糖組：葡萄糖量5.5 mmol/L;高糖組：葡萄糖量30 mmol/L;恩格列凈組：分別在30 mmol/L 高糖誘導(dǎo)時添加500 nmol/L、1000 nmol/L

恩格列凈工作液;陽性對照組：葡萄糖5.5 mmol/L+脫氧核糖核酸酶（DNase）。上述各組經(jīng)干預(yù)48 h

后，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，按照TUNEL染色試劑盒的方法進(jìn)行染色，制片完成后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞的凋亡情況以及恩格列凈對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的影響。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的多組定量資料比較用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，否則采用Kruskal-Waillis秩和檢驗。藥物干預(yù)實(shí)驗計量資料只進(jìn)行高糖組與其他組比較，其余實(shí)驗計量資料均進(jìn)行兩兩比較。

α= 0.05。

結(jié)果

一、HK-2細(xì)胞在不同葡萄糖濃度下SIRT1和TXNIP相對表達(dá)水平

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，使用不同葡萄糖濃度培養(yǎng)48 h后，5.5、30、50 mmol/L葡萄糖組SIRT1/β-actin分別為1.000±0.243、0.129±0.030、

0.227±0.099，TXNIP/β-actin分別為1.000±0.502、46.852±11.646、56.585±22.095，3組SIRT1和TXNIP的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意

義（FSIRT1 = 28.631，PSIRT1 = 0.001;FTXNIP = 12.708，PTXNIP = 0.007）。與5.5 mmol/L葡萄糖組相比，30、50 mmol/L葡萄糖組SIRT1表達(dá)均下降（P30 < 0.001，P50 = 0.001），TXNIP均上升（P30 = 0.008，P50 = 0.003）。30 mmol/L葡萄糖組與50 mmol/L葡萄糖組相比，SIRT1和TXNIP差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（PSIRT1 = 0.470，PTXNIP = 0.440），見圖1。

二、HK-2細(xì)胞用30 mmol/L葡萄糖干預(yù)不同時間后SIRT1和TXNIP蛋白相對表達(dá)水平

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，使用30 mmol/L

葡萄糖干預(yù)0、12、24 h，SIRT1/β-actin分別為

1.000±0.287、1.212±0.292、1.626±0.825，TXNIP/β-actin分別為1.000±0.917、0.341± 0.054、0.620±0.552。3組SIRT1和TXNIP的蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（FSIRT1 = 1.074，PSIRT1 = 0.399;FTXNIP = 1.206，PTXNIP = 0.363），見圖2。因此，可選擇30 mmol/L葡萄糖干預(yù)48 h進(jìn)行高糖干預(yù)HK-2細(xì)胞的實(shí)驗條件。

三、恩格列凈改善高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的凋亡

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h后，5.5 mmol/L葡萄糖組cleaved Caspase-3/β-actin為

1.000±0.297，高糖組（30 mmol/L）cleaved Caspase

-3/β-actin為9.263±0.791;分別給予250、500、1000 nmol/L的恩格列凈干預(yù)的高糖組cleaved Caspase-3/β-actin依次為8.686±1.005、5.967±0.458、1.083± 0.800。5組cleaved Caspase-3的蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H = 12.300，P = 0.015）。高糖組的cleaved Caspase-3水平均高于5.5 mmol/L糖組（P < 0.001）和500、1000 nmol/L恩格列凈與高糖共干預(yù)組（P500 = 0.001，P1000 < 0.001）;高糖組的cleaved Caspase-3水平與250 nmol/L恩格列凈與高糖共干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)（P = 0.348），見圖3。

TUNEL染色結(jié)果顯示，30 mmol/L葡萄糖組較5.5 mmol/L 葡萄糖組調(diào)亡細(xì)胞數(shù)多;經(jīng)恩格列凈干預(yù)后，500 nmol/L、1000 nmol/L恩格列凈與30 mmol/L葡萄糖共干預(yù)組較30 mmol/L 葡萄糖組凋亡細(xì)胞數(shù)少，見圖4。蛋白免疫印跡結(jié)果和TUNEL染色結(jié)果均顯示500 nmol/L和1000 nmol/L

恩格列凈能改善高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的凋亡，且1000 nmol/L恩格列凈的效果更顯著。

4.不同濃度恩格列凈干預(yù)HK-2細(xì)胞后SIRT1、TXNIP的相對表達(dá)水平

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，干預(yù)48 h后，5.5 mmol/L葡萄糖組SIRT1/β-actin為1.000±0.034，高糖組（30 mmol/L）SIRT1/β-actin為0.318± 0.225，分別給予250、500、1000 nmol/L恩格列凈干預(yù)的高糖組的SIRT1/β-actin分別為0.316±0.117、0.774±0.117、1.660±0.576。5.5 mmol/L葡萄糖組

TXNIP/β-actin為1.000±0.294，高糖組（30 mmol/L）TXNIP/β-actin為63.257±15.802，分別給予250、500、1000 nmol/L恩格列凈干預(yù)的高糖組的TXNIP/

β-actin分別為51.954±10.264、47.105±9.828、25.163± 3.363。5組SIRT1和TXNIP的蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（HSIRT1 = 11.551，PSIRT1 = 0.021;HTXNIP = 11.633，PTXNIP = 0.020）。高糖組與5.5 mmol/L葡萄糖組相比，SIRT1表達(dá)水平下降（P = 0.024），TXNIP表達(dá)水平升高（P < 0.001）。與高糖組相比，1000 nmol/L恩格列凈與高糖共干預(yù)組SIRT1表達(dá)水平升高，TXNIP表達(dá)水平下降（P均= 0.001）;高糖組與250、500 nmol/L恩格列凈與高糖共干預(yù)組SIRT1表達(dá)水平（P250 = 0.995，P500 = 0.158）和TXNIP表達(dá)水平（P250 = 0.181，P500 = 0.067）比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。由此可見，30 mmol/L 葡萄糖與1000 nmol/L 恩格列凈共干預(yù)48 h時可促進(jìn)SIRT1表達(dá)和抑制TXNIP表達(dá)。

討論

2019年美國和歐洲糖尿病協(xié)會共識推薦對T2DM伴發(fā)慢性腎臟病患者在二甲雙胍基礎(chǔ)上加用SGLT2抑制劑。既往研究表明，高糖會引起腎小管細(xì)胞的凋亡[15]。本研究證實(shí)恩格列凈可改善高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，與既往研究結(jié)果一致[16]。進(jìn)一步研究顯示，恩格列凈可降低30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞TXNIP表達(dá)水平。以往的研究者發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者腎臟組織和糖尿病小鼠腎臟組織中TXNIP的mRNA水平均升高，TXNIP蛋白水平在腎臟結(jié)構(gòu)異常之前已上調(diào)[17-18]。上述均提示腎靶向抑制TXNIP可能是預(yù)防和治療DKD的新策略。

ANDIS（All New Diabetics In Scania）是由瑞典Leif團(tuán)隊創(chuàng)始于2008年的大型糖尿病隊列，目的是研究糖尿病的異質(zhì)性，該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)DKD在嚴(yán)重胰島素抵抗糖尿?。⊿IRD）患者中發(fā)病率最高，強(qiáng)調(diào)了胰島素抵抗對DKD的重要性;SIRD患者在診斷時腎小球濾過率已較低，表明腎臟損傷的病理過程在糖尿病診斷前就已開始[19]。增強(qiáng)胰島素敏感性或許可以預(yù)防這類患者的DKD。SIRT1與胰島素敏感性和糖脂代謝密切相關(guān)，研究證實(shí)SIRT1對糖尿病患者的腎臟起保護(hù)作用，能延緩糖尿病的發(fā)生及發(fā)展[20-21]。本研究中高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平降低，予以恩格列凈治療后SIRT1表達(dá)水平升高，而TXNIP表達(dá)趨勢與之相反。亦有研究者發(fā)現(xiàn)SIRT1和TXNIP在抗衰老方面存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，但是它們之間的調(diào)控方式尚未清楚[22]。TXNIP是能量平衡和營養(yǎng)感知的重要中介;TXNIP可以抑制脂肪過量誘導(dǎo)的胰島素抵抗，同時增加脂肪細(xì)胞的儲存能力[23]。SIRT1與TXNIP是否共同調(diào)節(jié)胰島素抵抗，改善腎臟細(xì)胞的凋亡也需要作進(jìn)一步探討。

綜上所述，恩格列凈可能通過上調(diào)SIRT1表達(dá)及下調(diào)TXNIP表達(dá)來改善HK-2細(xì)胞凋亡。然而具體的調(diào)控機(jī)制，需分別沉默HK-2細(xì)胞目的基因SIRT1和TXNIP后再進(jìn)行實(shí)驗以進(jìn)一步證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-12-08）

（本文編輯：洪悅民）