王興紅 鄧海峰 孫縵利 韓 坤 王丹萍

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,河南 漯河 462000；2.河南省特醫(yī)食品工程技術(shù)研究中心,河南 漯河 462000；3.漯河市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,河南 漯河 462000）

糖尿病腎臟疾?。―KD）指臨床考慮由糖尿病（DM）引起的腎臟病變，是DM引起的嚴(yán)重和危害性最大的一種慢性并發(fā)癥，也是目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一。DKD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，最新的研究提出了“炎癥發(fā)病機(jī)制”和抗感染治療措施。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，因具有廣泛的藥理作用，愈來愈受到人們的重視，它是具有多靶點(diǎn)作用和綜合治療優(yōu)勢的中藥單體[1]。槲皮素對(duì)糖尿病大鼠腎臟并發(fā)癥具有防治作用，但機(jī)制尚未明確[2]。課題組前期研究槲皮素可以抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織中NF-κB的表達(dá)發(fā)揮對(duì)糖尿病DKD大鼠的保護(hù)作用[3]，為進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制，本研究觀察槲皮素對(duì)糖尿病大鼠腎組織中TLR4/NF-κB/Snail1信號(hào)通路的影響，為槲皮素防治DKD的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

槲皮素，普利斯公司生產(chǎn)，純度≥98%，批號(hào)180113，其色譜圖如圖1所示；驍悉，上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)180123。

圖1 槲皮素色譜圖

1.2 動(dòng)物

成年健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重300～350 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)410117）。全部大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素美國Sigma公司生產(chǎn)，純度≥98 %（HPLC），批號(hào)為20 180911；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和白細(xì)胞介素8（IL-8）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號(hào)分別為180920、181021、180911和180423）；轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）ELISA試劑盒批號(hào)180912、纖維連接蛋白（FN）ELISA試劑盒批號(hào)180820、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）ELISA試劑盒批號(hào)181010購自德國Siemens公司；Snail1小鼠抗大鼠單克隆（抗體批號(hào)181009）、TLR4小鼠抗大鼠單克隆（抗體批號(hào)180907）、NF-κB P65小鼠抗大鼠單克隆抗體（批號(hào)181020）、TGF-β1小鼠抗大鼠單克隆（抗體批號(hào)171008）、α-SMA小鼠抗大鼠單克?。贵w批號(hào)170911）、collagenШ小鼠抗大鼠單克隆（抗體批號(hào)181123）購自美國Santa Cruz公司；α-tubulin（批號(hào)180320）購自北京博奧森生物公司。

1.4 儀器

UV-7501紫外分光光度計(jì)（無錫科達(dá)儀器廠），三諾SXT-1型快速血糖測定儀（長沙），ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀（美國），CM1900-1-1恒冷箱冰凍切片機(jī)（Leica德國），倒置光顯微鏡（Leica德國），Power-pac200電泳儀（美國BIO-RAD公司），Trans-Blot電泳濕轉(zhuǎn)儀（美國BIO-RAD公司）。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物模型的建立與分組

成年健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱量體重，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg。注射前動(dòng)物禁食12 h，不禁水。注射后48 h尾靜脈取血，測定血糖，以血糖≥16.65 mmol/L為糖尿病大鼠。正常對(duì)照組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。在實(shí)驗(yàn)過程中由于高糖死亡而不能完成血糖測定的大鼠，不列入統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組、陽性藥物組（驍悉11 mg/kg，臨用前用生理鹽水配成含驍悉10 g/L的溶液，每日灌胃）和槲皮素組（25、50 mg/kg，臨用前用生理鹽水配成含槲皮素10 g/L的溶液）每日灌胃治療。正常組和糖尿病模型組按體重?fù)Q算等體積的生理鹽水灌胃。

1.5.2 標(biāo)本采集與處理

第8周末各組大鼠心臟采血備用并立即處死，剖腹取雙側(cè)腎臟標(biāo)本，用濾紙吸干水分，去包膜，稱重，計(jì)算腎臟肥大指數(shù)（KW/BW，腎臟肥大指數(shù)=雙側(cè)腎質(zhì)量/體質(zhì)量×% ）。右腎-70 ℃凍存?zhèn)溆?；左腎固定、石蠟包埋做4μm厚度非連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察腎小球病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5.3 血糖

采用快速血糖儀測定。

1.5.4 血BUN，Scr及24 h尿蛋白測定

用OLYMBUSAU-600全自動(dòng)生化分析儀測BUN，Scr，采用雙縮脲法測定24 h尿蛋白的含量。

1.5.5 血清IL-8、TGF-α、FN、PAI-1檢測

ELISA法測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.6 腎組織MDA，GSH-Px檢測

取右腎，用冰冷生理鹽水清理血跡，用濾紙吸干，取組織約150 mg，置于2.0 mL玻璃勻漿器中制備10%的組織勻漿，離心（2500 r/ min離心10 min），取上清放置4 ℃?zhèn)溆?。MDA，GSH-Px測定應(yīng)用紫外分光光度計(jì)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.7 免疫組織化學(xué)SP法測定腎組織Snail1的含量

取腎組織切片烤片，常規(guī)脫蠟至水、抗原微波熱修復(fù)、山羊血清液封閉；滴加Snail1一抗(1:100稀釋)，4 ℃孵育1 h，滴加抗小鼠生物素化二抗孵育10 min，滴加HRP標(biāo)記鏈親和素孵育10 min，滴加DAB顯色，蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片，顯微鏡觀察。Snail1蛋白表達(dá)以細(xì)胞或結(jié)構(gòu)周圍不同程度的棕黃色為陽性。根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，觀察各組大鼠腎Snail1的定位和表達(dá)。每只大鼠觀察6張切片，每張切片于400倍鏡下隨機(jī)選取不重復(fù)的5個(gè)陽性視野。觀察陽性染色部位并采集圖像后結(jié)合IMAGE J軟件分析求得平均光密度值（IOD）。

1.5.8 Western blot測定腎組織TLR4、NF-κBP65、TGF-β1、α-SMA和collagenШ蛋白的含量

取右腎組織，用苯甲基磺酰氟攝取蛋白質(zhì)，用BCA法測定總蛋白含量。蛋白樣品行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，加入一抗TLR4(1：1 000)、NF-κBP65(1：1000)、TGF-β1(1：1000)、α-SMA(1：1 000)和col-Ш(1：1 000)4 ℃過夜，傾去一抗，TBST洗膜3次，每次15 min。洗滌后二抗孵育[羊抗小鼠抗體(1：5 000)]，置于搖床上搖動(dòng)，室溫下1 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次15 min；ECL發(fā)光劑暗室曝光成像、拍照。Western印跡條帶經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描處理，計(jì)算單位光密度值和條帶面積，將各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的總光密度值與對(duì)照組比較，得到相對(duì)百分?jǐn)?shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料用表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

與正常對(duì)照組大鼠做比較，成功建成糖尿病模型組的大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食的癥狀，毛發(fā)色澤黯淡，精神萎靡，活動(dòng)減少的表現(xiàn)。隨著病程延長，除大鼠體重呈下降趨勢外，其他癥狀更加明顯；與糖尿病模型組比較，槲皮素25mg/kg、50mg/kg治療8周后，上述癥狀體征得到改善，效果同驍悉組。

2.2 對(duì)糖尿病大鼠血BUN，Scr，24h尿蛋白、腎臟肥大指數(shù)的影響

如圖2所示。與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血BUN，Scr，24 h尿蛋白、腎臟肥大指數(shù)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg組，大鼠血BUN，Scr，24 h尿蛋白、腎臟肥大指數(shù)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），效果同驍悉組。

圖2 各組血BUN，Scr，24h尿蛋白、腎臟肥大指數(shù)比較 (,n=6)

2.3 對(duì)糖尿病大鼠血清IL-8,TGF-α,FN,PAI-1含量的影響

如圖3所示。與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血清炎癥因子IL-8,TGF-α,FN,PAI-1含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg組，大鼠血清上述炎癥因子顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），效果同驍悉組。

圖3 各組血清IL-8,TGF-α,FN,PAI-1含量比較 (,n=6)

2.4 對(duì)糖尿病大鼠腎組織Snail1表達(dá)的影響

如圖4所示。與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠腎組織Snail1表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg組大鼠腎組織Snail1表達(dá)顯著降低（P＜0.01），效果同驍悉組。

圖4 大鼠腎組織Snail1的表達(dá)（免疫組化SP法，×400）

2.5 對(duì)糖尿病大鼠腎組織TLR4、NF-κBP65、TGF-β1、α-SMA和col-Ш蛋白表達(dá)的影響

如圖5、圖6所示。與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠腎組織TLR4、NF-κBP65、TGF-β1、α-SMA和col-Ш蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg組，大鼠腎組織TLR4、NFκBP65、TGF-β1、α-SMA和collagenШ表達(dá)顯著降低（P＜0.01）蛋白，效果同驍悉組。

圖5 大鼠腎組織NF-κB P65的表達(dá) (Western blot檢測)

圖6 大鼠腎組織TLR4、TGF-β1、α-SMA和col-Ш蛋白表達(dá)(Western blot檢測)

3 討論

DKD是糖尿病最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。近年來，免疫炎癥學(xué)說認(rèn)為糖尿病是一種天然免疫激活和慢性低度炎癥反應(yīng)為特征的疾病[4]。在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，TLR4和NF-κB是信號(hào)通路的關(guān)鍵因子。TLR4能促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR4在腎臟中主要存在于腎小管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞。TLR4可以介導(dǎo)多種炎癥及急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子形成，有研究證實(shí)其在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5]。

DN早期存在明顯的巨噬細(xì)胞浸潤[6]。NF-κB是炎癥調(diào)控的中心環(huán)節(jié)[7]。研究表明[8]，單核巨噬細(xì)胞可以通過膜表面TLR感受PAMP刺激，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終由進(jìn)入胞核內(nèi)活化的NF-κB啟動(dòng)核內(nèi)相關(guān)基因，合成IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-α等多種促炎因子并釋放到細(xì)胞外，并形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)。同時(shí)NF-κB可促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAMP-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）等炎癥介質(zhì)的釋放[9]。腫瘤壞死因子（TNF-α），IL-8 是急性炎癥的標(biāo)志性致炎因子，TNF-α 被認(rèn)為是炎癥發(fā)病機(jī)制中的前炎癥因子，可刺激 IL-8 的釋放，兩者共同參與了多種因素所致的腎損傷[10-12]；NF-κB激活單核細(xì)胞，激活的單核/巨噬細(xì)胞可通過釋放腫瘤壞死因子（TNF-α）、血小板衍化生長因子等細(xì)胞因子及分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 加劇炎癥,刺激系膜細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白（FN）導(dǎo)致腎小球硬化[13-14]。TLR4可能是NF-κB的上游信號(hào)分子，是DN發(fā)生的始動(dòng)信號(hào)之一。

有研究表明[15]，Snail1在DM大鼠腎小管高表達(dá)，并能通過介導(dǎo)FN生成觸發(fā)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而參與DKD的發(fā)生和發(fā)展。因此，有效干預(yù)TLR4/NF-κB/Snail1通路成為治療DKD 的重要手段。糖尿病時(shí)腎臟Snail1蛋白表達(dá)增多，可損傷腎臟固有細(xì)胞,細(xì)胞損傷后釋放前炎介質(zhì),導(dǎo)致白細(xì)胞濾出到損傷部位并活化，釋放更多的炎癥趨化因子（IL-8,TGF-α,FN,PAI-1等）[16-18]。炎癥因子已成為DN持續(xù)發(fā)展過程中的重要危險(xiǎn)因素[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠腎組織TLR4、NF-κBP65、TGF-β1、α-SMA和col-Ш蛋白表達(dá)增加，血清炎癥因子IL-8,TGF-α,FN,PAI-1含量增加。提示糖尿病狀態(tài)下存在明顯的炎癥反應(yīng)過程。

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，存在于多種植物的花、葉、果實(shí)中，具有抗氧化、抗炎、抗黏附、抗血栓、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂、降低血壓，以及免疫調(diào)節(jié)作用[20-22]。課題組前期研究槲皮素可以降低腎組織氧化應(yīng)激水平和增強(qiáng)抗氧化能力，并減少BUN,Scr,24h蛋白尿，發(fā)揮保護(hù)糖尿病腎臟的作用[23]。本研究進(jìn)一步探討了槲皮素對(duì)DKD保護(hù)作用機(jī)制，本研究結(jié)果顯示槲皮素能通過抑制TLR4/NF-κB/Snail1信號(hào)通路來減少血清多種炎癥因子IL-8,TGF-α,FN,PAI-1的釋放，進(jìn)而減少腎組織低度炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗纖維化作用，從而發(fā)揮對(duì)腎組織和腎功能的保護(hù)作用。其效果同陽性藥物驍悉。驍悉的成分是嗎替麥考酚酯，霉酚酸酯（簡稱MMF）是霉酚酸（MPA）的2-乙基酯類衍生物。MPA是高效、選擇性、非競爭性、可逆性的次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶(IMPDH)抑制劑，可抑制鳥嘌呤核苷酸的經(jīng)典合成途徑。MPA對(duì)淋巴細(xì)胞具有高度選擇作用。嗎替麥考酚酯適用于接受同種異體腎臟或肝臟移植的患者中預(yù)防器官的排斥反應(yīng)。綜上提示，槲皮素通過其抗炎的作用機(jī)制發(fā)揮對(duì)DKD的保護(hù)作用，可能通過調(diào)控腎臟TLR4/NF-κB/Snail1信號(hào)通路、減輕炎癥有關(guān)。本研究可能為探明槲皮素的藥物治療的靶點(diǎn)提供可靠靶點(diǎn)，但具體的途徑還有待于進(jìn)一步的研究。