張家瑞， 張 力， 屈勇剛*， 連曉春， 李 靜， 常軍帥， 李 巖*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，烏魯木齊 830063)

牛結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌引起的一種慢性消耗性人獸共患病。各國通常采用檢疫和撲殺的策略來防控牛結(jié)核病。但當(dāng)檢疫中出現(xiàn)假陽性牛被撲殺的情況時便會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，人們開始對造成檢疫結(jié)果出現(xiàn)假陽性的原因進(jìn)行調(diào)查研究[1]。曾有人研究發(fā)現(xiàn)由于規(guī)?；B(yǎng)殖的牛群每年需要進(jìn)行PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢疫牛結(jié)核病，并且在多次接種PPD時常會出現(xiàn)使用不同批次的PPD和皮下注射PPD等情況，這時就可能會對PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢疫造成影響[2]。為此，人們對干擾PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢疫的影響因素進(jìn)行了許多相關(guān)研究。其中，關(guān)于混用不同批次PPD進(jìn)行牛結(jié)核病復(fù)檢時對PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢疫結(jié)果判定是否產(chǎn)生干擾的公開數(shù)據(jù)是相互矛盾的，同時也缺乏對牛只進(jìn)行復(fù)檢時多次皮下接種PPD是否會產(chǎn)生影響的相關(guān)數(shù)據(jù)[3]。另外，由于牛模型存在材料昂貴、操作不便等限制，使得進(jìn)行該類研究的難度大大增加，因此對牛分枝桿菌同樣敏感，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)也非常強(qiáng)烈的豚鼠模型被重新利用起來[4]。本研究首次利用豚鼠作為動物模型探究在牛結(jié)核病檢疫中出現(xiàn)的使用不同批次的PPD和皮下注射PPD等情況是否會對檢疫結(jié)果的判定造成干擾，以為建立更簡單、安全、可靠的牛結(jié)核病檢測與凈化方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品

結(jié)核菌素提純蛋白衍化物(PPD)(規(guī)格：50頭份/瓶，批號：201003、201801)由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)，皮試實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水稀釋至50 IU/mL的皮試濃度。0.9%氯化鈉注射液(規(guī)格：500 mL，4.5 g/瓶，批號：1908263B)由西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)動物及分組

清潔級豚鼠24只，雌雄各12只，6～9周齡，飼養(yǎng)環(huán)境良好，自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2020-0003。實(shí)驗(yàn)動物飼料生產(chǎn)許可證：蘇飼證(2019)07014。均購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

24只豚鼠隨機(jī)分為4組：標(biāo)準(zhǔn)參照組(同一批次PPD皮內(nèi)注射，批號：201801)、皮內(nèi)組(不同批次PPD皮內(nèi)注射，批號：201003和201801)、皮下組(同一批次PPD皮下注射，批號：201801)和生理鹽水組(0.9%氯化鈉注射液)。

1.3 皮膚試驗(yàn)

參照《結(jié)核菌素提純蛋白衍化物(PPD)制造及檢定規(guī)程》中的“致敏作用試驗(yàn)”進(jìn)行部分試驗(yàn)設(shè)計。豚鼠經(jīng)7 d適應(yīng)期后，在試驗(yàn)前對豚鼠一側(cè)背部皮試區(qū)進(jìn)行脫毛處理。皮試前應(yīng)檢查脫毛處皮膚是否存在外傷，若存在外傷將選擇另一側(cè)重新脫毛進(jìn)行試驗(yàn)，并做好相關(guān)記錄。標(biāo)準(zhǔn)參照組每只皮內(nèi)注射0.1 mL(5 IU)的PPD(批號：201801)；皮內(nèi)組交替注射2個批號的PPD(批號：201003和201801)；皮下組每只皮下注射0.1 mL(5 IU)的PPD(批號：201801)。生理鹽水組每只皮內(nèi)注射0.1 mL的0.9%氯化鈉注射液。各組每隔2周進(jìn)行1次皮試，并于每次皮試后24 h，48 h，72 h分別觀察記錄豚鼠皮試部位反應(yīng)情況，共3次。在第3次注射的2周后所有豚鼠統(tǒng)一注射PPD(批號：201801)進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，并分別觀察記錄皮試后24 h，48 h，72 h皮試部位反應(yīng)情況。

2 結(jié)果與分析

在本次試驗(yàn)中，陰性組所有豚鼠經(jīng)0.9%氯化鈉皮內(nèi)注射后，注射處(↓)均可見豌豆樣腫塊，表明皮內(nèi)注射成功。在試驗(yàn)各階段均未觀察到豚鼠皮試處出現(xiàn)明顯異常和皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)。另在第3次皮試前發(fā)現(xiàn)部分豚鼠皮膚存在外傷，改為右側(cè)重新脫毛進(jìn)行試驗(yàn)，見圖1。

注：A為皮內(nèi)注射后0 h；B為第1次皮試72 h后；C為第2次皮試72 h后；D為第3次皮試72 h后；E為第4次皮試72 h后。下同。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)參照組試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過使用PPD(批號：201801)對標(biāo)準(zhǔn)參照組豚鼠進(jìn)行皮內(nèi)注射后，該組所有豚鼠注射處(↓)均可見豌豆樣腫塊，表明皮內(nèi)注射成功。并于每次皮試后的24 h，48 h和72 h在皮試部位均未觀察到局部紅斑硬結(jié)，見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)參照組皮膚試驗(yàn)結(jié)果

2.2 皮內(nèi)注射不同批次PPD皮膚試驗(yàn)結(jié)果

對皮內(nèi)組所有豚鼠進(jìn)行皮內(nèi)多次交替注射不同批次的PPD(批號：201003和201801)，注射后該組所有豚鼠注射處(↓)均可見豌豆樣腫塊，表明皮內(nèi)注射成功。并于每次皮試后的24 h，48 h和72 h在皮試部位均未觀察到局部紅斑硬結(jié)，見圖3。

圖3 皮內(nèi)組皮膚試驗(yàn)結(jié)果

2.3 皮下注射同一批次PPD皮膚試驗(yàn)結(jié)果

使用同一批次的PPD(批號：201801)通過皮下注射法對豚鼠進(jìn)行皮試，該組所有豚鼠注射處(↓)均未見豌豆樣腫塊，表明皮下注射成功。另在第3次皮試前發(fā)現(xiàn)部分豚鼠皮膚存在外傷，改為右側(cè)重新脫毛進(jìn)行試驗(yàn)。并于每次皮試后的24 h，48 h和72 h在皮試部位均未觀察到局部紅斑硬結(jié)，見圖4。

圖4 皮下組皮膚試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

牛結(jié)核病是一種關(guān)乎人類健康和食品公共安全的人畜共患病。在許多國家，始終認(rèn)為基于檢疫和撲殺的策略能夠有效防控牛結(jié)核病[5]。在檢疫中主要采用以細(xì)胞免疫為基礎(chǔ)的檢測方法，即PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)是目前被世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，OIE)認(rèn)可的監(jiān)測和控制牛結(jié)核病的手段之一[6]。但隨著規(guī)?；B(yǎng)殖中檢疫的日益頻繁，隨之而來的關(guān)于在檢疫中誤殺假陽性牛的情況也變得日益嚴(yán)重。同時，由于規(guī)?；B(yǎng)殖的牛群每年多次接種PPD進(jìn)行牛結(jié)核病檢疫間隔較長，不能保證每次檢疫都使用同一批次的PPD以及出現(xiàn)未嚴(yán)格按規(guī)范的要求進(jìn)行皮內(nèi)接種，而將PPD注射到皮下的情況。于是便有人質(zhì)疑在PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢疫過程中使用不同批次的PPD和皮下注射PPD等這類人為因素，可能會干擾PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢疫結(jié)果的判定[7]。同時，重復(fù)該類研究存在著試驗(yàn)動物的耗資大的問題。所以，人們開始選用一些高效低價的動物模型來降低成本。豚鼠便成為了評價和驗(yàn)證多種免疫試驗(yàn)的首選模型之一。由于豚鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)烈，常常被應(yīng)用于結(jié)核相關(guān)檢測生物制劑和新型檢測方法的評價試驗(yàn)，同時也已成為PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)效能評定的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。

因此，本研究為了探究在牛結(jié)核病檢疫中出現(xiàn)的使用不同批次的PPD和皮下注射PPD等情況是否會對檢疫結(jié)果的判定造成干擾，選用同樣可產(chǎn)生強(qiáng)烈遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的豚鼠作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并參照《結(jié)核菌素提純蛋白衍化物(PPD)制造及檢定規(guī)程》中的“致敏作用試驗(yàn)”進(jìn)行部分試驗(yàn)設(shè)計[9]。本試驗(yàn)通過對豚鼠背部經(jīng)過多次皮內(nèi)注射同一批次的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核菌素后觀察到每次皮試后24 h，48 h和72 h均未出現(xiàn)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，該試驗(yàn)結(jié)果同上述規(guī)程中的結(jié)果一致，證明使用質(zhì)量合格的同一批次的PPD多次進(jìn)行PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢疫時不會干擾檢疫結(jié)果的判定。該結(jié)果與Gormley等人[10]的部分試驗(yàn)結(jié)論相符合，對人工感染牛分枝桿菌前的牛只進(jìn)行多次頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測時，雖然會在皮試試驗(yàn)期間出現(xiàn)皮厚差稍有增加的情況，但與整個試驗(yàn)的結(jié)果比較無差異。

本研究中使用同一廠家不同批次的結(jié)核菌素交替皮內(nèi)接種豚鼠后觀察到每次皮試后24h，48 h和72 h均未出現(xiàn)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，該結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參照組皮試結(jié)果無差異。同時也與王宏偉等人[11]的研究結(jié)論相符合，其試驗(yàn)通過對不同廠家的牛型提純結(jié)核菌素進(jìn)行一系列臨床研究，其結(jié)果顯示兩種出產(chǎn)自不同廠家的PPD具有較高陽性符合率，陰性符合率甚至達(dá)到了100%，間接證明了PPD的批次不是干擾檢測結(jié)果判定的因素。但也有與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異的報道，如衛(wèi)龍興等人[12]通過采用同一廠家的不同批次的結(jié)核菌素對存在自然感染的牛群進(jìn)行結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)后，研究發(fā)現(xiàn)使用不同批次PPD進(jìn)行的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果差異顯著。該試驗(yàn)結(jié)論雖與本試驗(yàn)結(jié)果有所不同，但均未出現(xiàn)假陽性的情況。依然表明了使用不同批次的PPD進(jìn)行PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢疫時不會對檢疫結(jié)果判定造成影響。

與此同時，本試驗(yàn)還進(jìn)行了多次皮下注射同一批次的PPD，試驗(yàn)結(jié)果表明多次皮下注射PPD不會引起豚鼠產(chǎn)生特異性遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，該結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參照組皮試結(jié)果無差異。本試驗(yàn)結(jié)果同時與Victoria等人[13]的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果相符合，其研究通過對感染過分枝桿菌的兒童同時進(jìn)行皮內(nèi)和皮下注射結(jié)核菌素，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在同一試驗(yàn)個體的兩處皮試處產(chǎn)生的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度無差異，說明結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的注射途徑不會干擾變態(tài)反應(yīng)的結(jié)果判定。

Coad等人[14]還在自然感染牛分枝桿菌的牛中發(fā)現(xiàn)，短時間內(nèi)重復(fù)進(jìn)行皮膚試驗(yàn)可能導(dǎo)致皮膚試驗(yàn)反應(yīng)性的逐步降低，這對檢測存在不確定性的感染動物具有潛在的負(fù)面影響。對于假陰性的干擾，由于本研究現(xiàn)階段存在諸多方面的限制，只能在往后的試驗(yàn)中再進(jìn)行研究。