朱 浩， 王 坤， 徐 崇， 儲雙鳳， 楊 奕， 楊章平*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009;2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

目前引起肺炎克雷伯菌耐藥性的主要原因是細菌產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase，ESBLs)，這也是造成抗菌治療失敗的重要原因。β-內(nèi)酰胺酶基因型可以分為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因型(blaSHV、blaTEM、blaCTX-M等)、染色體介導(dǎo)的基因型(blaSHV、blaOKP、blaLEN等)，以及耐酶抑制劑酶(IRTs)基因型(blaSHV、blaTEM等)。

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonice)是一種人獸共患菌，其廣泛分布于人和許多動物的呼吸及消化道，可引起人和動物的多種疾病。肺炎克雷伯菌首次獲得時間是在19世紀90年代，是從患有大葉性肺炎病人的肺臟組織中得到，此后，國內(nèi)外學(xué)者相繼從患病的豬、牛、雞、鴨等多種家畜和家禽體內(nèi)分離到了該菌，并開展了相關(guān)的研究。但長期以來，肺炎克雷伯菌對畜禽業(yè)的巨大危害并沒有引起人們的足夠重視。近年來由于β-內(nèi)酰胺酶類、喹諾酮類等不同類型抗生素的大量用，使得多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，增加了藥物治療的難度。由于抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致多重耐藥菌種的出現(xiàn)，使該菌感染引起的畜禽的疫情頻繁發(fā)生，造成了重大經(jīng)濟損失，嚴重影響了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。鑒于此，本研究通過對其耐藥機制的研究，不僅為奶牛乳房炎指導(dǎo)用藥提供理論依據(jù)，而且對細菌基因轉(zhuǎn)移機制提供一定的學(xué)術(shù)和理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

于2017年4月—2018年9月在江蘇(宿遷和淮安)和山東(日照)的牛場采集并分離純化、鑒定的肺炎克雷伯菌71株。

1.2 試劑和藥品

營養(yǎng)肉湯，藥敏紙片，細菌基因組DNA提取試劑盒(購于天根生化科技有限公司)，50X TAE緩沖液，瓊脂糖，GoldView Ⅰ型核酸染色劑。

1.3 主要儀器

DK-600電熱恒溫水浴鍋，無菌培養(yǎng)皿，無菌錐形瓶，移液器，ZD-85A數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器，PL-303電子天平，藍光凝膠成像系統(tǒng)。

1.4 藥敏試驗

將保存的71株菌株重新命名為“K1、K2、K3…K71”并按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中，將復(fù)蘇后的菌株接種到普通培養(yǎng)基中，挑取單個菌株接種到LB肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)18～24 h，對每管菌液進行稀釋，稀釋至0.5個麥氏單位；用無菌棉拭子蘸取菌液均勻分布在MH瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子取藥敏片貼于平板表面，并將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，用卡尺測量抑菌圈直徑。

1.5 雙紙片確證表型篩選

選擇頭孢噻肟和頭孢他啶進行初步篩選，頭孢噻肟抑菌圈≤27 mm，頭孢他啶抑菌圈≤22 mm，至少一種紙片呈現(xiàn)上述狀況，指示產(chǎn)ESBLs，對于指示產(chǎn)ESBLs的菌株，使用頭孢他啶，頭孢噻肟以及含有棒酸的頭孢他啶和頭孢噻肟4種藥敏片。對任意一組藥物，含棒酸和不含棒酸的抑菌圈相比，若增加值≥5 mm時，則表示該菌產(chǎn)ESBLs。

1.6 肺炎克雷伯菌DNA提取

根據(jù)試劑盒步驟進行抽提，取菌液1 mL，10 000 r/min離心1 min，吸凈上清，向菌體沉淀中加入200 μL緩沖液，振蕩至菌體徹底懸浮。

向管中加入20 μL Proteinase K溶液，混勻。加入220 μL緩沖液GB，振蕩15 s，70 ℃放置10 min，溶液變清亮，簡短離心去除管壁的水珠。加220 μL無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，簡短離心去除管壁的水珠。

將所得溶液和絮狀沉淀加入吸附柱CB3，離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中，向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中，向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中，此操作需要重復(fù)1次。

將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3放置于室溫環(huán)境，徹底晾干吸附柱殘余的漂洗液。

將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈離心管，向吸附膜中間部位懸空滴加100 μL洗脫液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.7 PCR檢測bla-SHV基因

PCR反應(yīng)條件：PCR擴增采用50 μL體系，正反引物各2 μL；DNA模板：1 μL；2×M5TapPCRMix：27.5 μL；dd H2O：27.5 μL。SHV基因反應(yīng)參數(shù)：93 ℃預(yù)變性2 min；93 ℃變性30 s；57.2 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃反應(yīng)5 min(表1)。

表1 基因引物序列

取5 μL PCR擴增產(chǎn)物加入2%已經(jīng)加入GoldView Ⅰ核酸染料瓊脂糖凝膠上電泳，恒壓110 V，電泳20 min，將膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

1.8 bla-SHV基因水平接合實驗

選擇含bla-SHV基因的5株肺炎克雷伯菌作為供體菌，大腸桿菌C600作為受體菌，用瓊脂稀釋法測得其對于鏈霉素和頭孢噻肟的MIC值，配制梯度濃度鏈霉素平板：取3.8 g MH培養(yǎng)基溶解于90 mL超純水中,放置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min，配制10 240 μg/mL鏈霉素溶液，取20 mL加入于50 mL離心管中，倍比稀釋從其中取10 mL藥液加入含有10 mL超純水的50 mL離心管中，充分混勻后重復(fù)上述操作，直至稀釋至最后一個梯度；配制梯度濃度的頭孢噻肟平板：配制1 280 μg/mL頭孢噻肟溶液，取20 mL加入于50 mL離心管中,倍比稀釋從其中取10 mL藥液加入含有10 mL超純水的50 mL離心管中，充分混勻后重復(fù)上述操作。將受試菌株及大腸桿菌C600按照1∶100接種于LB肉湯培養(yǎng)基中37 ℃，225 r/min培養(yǎng)5～6 h，取1 mL菌液離心PBS重懸調(diào)節(jié)菌液濁度為0.5麥氏濁度。拭子蘸取少量菌液擠去多余菌液，蘸于不同藥物濃度平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。同時接種菌液至不含藥物的平板上作為對照。觀察菌株在平板上生長情況。觀察到有明顯的至少1個菌落即判定為生長，由低濃度到高濃度觀察第1個不生長的平板藥物濃度即為最小抑菌濃度。

配制含1 024 μg/mL鏈霉素和4 μg/mL頭孢噻肟的LB平板，配制同時含10 240 μg/mL鏈霉素和40 μg/mL頭孢噻肟溶液10 mL,同樣按照1∶9比例加入90 mL LB培養(yǎng)基中混勻充分，傾倒平板并做好標記。將供、受體菌1∶100分別接種于LB肉湯中37 ℃，225 r/min培養(yǎng)5～6 h。供、受體菌按1∶3比例輕微混勻，37 ℃靜置30 min使其發(fā)生接合反應(yīng)。涂布于含1 024 μg鏈霉素和4 μg頭孢噻肟的LB平板上過夜培養(yǎng)，供體菌受到鏈霉素的抑制而不生長，大腸桿菌C600受到頭孢噻肟的抑制而不生長，而發(fā)生接合菌則能夠在同時含有二者藥物的平板上生長。以“Con”(conjugation)為開頭重新命名獲得的接合子，數(shù)字對應(yīng)原肺炎克雷伯菌株。對接合子進行表型確證實驗，確定接合子是否為ESBLs菌株，以及比較供體菌與受體菌耐藥表型變化。此外檢測供體菌和受體菌前后頭孢噻肟MIC值有無明顯變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果如表2，71株肺炎克雷伯菌株對頭孢他啶、哌拉西林、環(huán)丙沙星、氨曲南、美羅培南敏感，敏感率達100%，對阿莫西林耐藥，耐藥率達100%，對于氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢哌酮的耐藥率分別為71.83%，52.11%，50.70%。

表2 71株肺炎克雷伯藥敏試驗結(jié)果

2.2 雙紙片表型確證實驗結(jié)果

頭孢噻肟抑菌圈和頭孢噻肟/棒酸抑菌圈相比有明顯的變化，抑菌圈相差≥5 mm，最終通過表型值確定了7株攜帶菌株,分別為K1、K3、K6、K13、K19、K27、K31。

2.3 bla-SHV基因檢測結(jié)果

基因檢測結(jié)果如圖1，表型確證實驗中確定的7株菌株，均為攜帶bla-SHV基因。

圖1 SHV型ESBLs基因型鑒定電泳

2.4 接合實驗結(jié)果

測得供體菌和受體菌對于頭孢噻肟和鏈霉素MIC值如表3，供體菌表現(xiàn)對于鏈霉素MIC均<1 024 μg/mL,頭孢噻肟MIC≥32 μg/mL,而大腸桿菌C600對于鏈霉素MIC>1 024 μg/mL,頭孢噻肟MIC<0.062 5 μg/mL,選擇1 024 μg/mL鏈霉素可抑制供體菌生長而選擇4 μg/mL頭孢噻肟可抑制大腸桿菌C600生長。所以選擇同時含有二者藥物的平板進行接合子的篩選。最終獲得3株接合子，耐藥表型如表4，表型確證實驗確認都是ESBLs菌株，接合子與供體菌MIC值變化如表5。

表3 供體菌鏈霉素和頭孢噻肟MIC值

表4 供體菌與接合子耐藥表型

表5 供體菌與接合子頭孢噻肟MIC值變化

3 討 論

由于大量使用β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，肺炎克雷伯菌產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶，增加了藥物治療的難度，造成了相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)的重大經(jīng)濟損失，嚴重影響了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，這也是造成治療失敗的重要原因，本研究主要針對bla-SHV耐藥基因，從山東、江蘇兩地區(qū)獲得的71株肺炎克雷伯菌中，攜帶bla-SHV耐藥基因的菌株共有12株(15.38%)。

肺炎克雷伯菌產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因在質(zhì)粒上，本次試驗中，共獲得3株接合子，受體菌獲得對于TE、AMP、GEN等多種藥物耐藥，說明其耐藥基因可通過接合型質(zhì)粒發(fā)生轉(zhuǎn)移，雙紙片表型確證實驗表明這3株接合子是產(chǎn)ESBLs，整個試驗過程中發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對頭孢噻肟耐藥，對于頭孢他啶等藥物較敏感，3株接合子除Con1以外頭孢噻肟MIC值無明顯變化，Con1頭孢噻肟MIC值由>128 μg/mL降低為64 μg/mL。