文信旺， 賈銀海， 潘 銳， 吳思謙， 黃 香*，戴黃山， 黃明光， 梁金逢， 周曉情， 王啟芝

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，南寧 530001；2.廣西家畜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；3.廣西融安縣板欖鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站 廣西 融安 545400)

近年來，牛同期發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎移植等生物工程技術(shù)發(fā)展迅速，相關(guān)技術(shù)日臻成熟。牛的卵巢正常含有數(shù)十萬個(gè)卵母細(xì)胞，正常情況下，每1個(gè)發(fā)情周期只有1個(gè)卵子成熟并參加受孕[1]。但為了獲得更多可用卵子和胚胎，加快牛繁育進(jìn)程，可以通過超數(shù)排卵技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。影響牛超數(shù)排卵效果因素較多，牛的品種、年齡、飼養(yǎng)管理、氣候條件、藥品種類、超排及采胚技術(shù)等。本次試驗(yàn)旨在分析廣西肉牛繁育關(guān)鍵技術(shù)實(shí)施現(xiàn)狀，探討切實(shí)有效的技術(shù)，為助力廣西肉牛產(chǎn)業(yè)脫貧攻堅(jiān)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年9—10月在廣西賓陽、都安、大化、崇左4個(gè)肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)各選擇16頭西門塔爾成年母牛進(jìn)行超數(shù)排卵試驗(yàn)，試驗(yàn)牛生產(chǎn)性能良好，遺傳穩(wěn)定，系譜清楚，體格健康，無傳染病,無繁殖性疾病，胎次在3胎以下。采用孕酮栓(GIOB)+促卵泡素(FSH)+氯前列烯醇(PGF2)的方法對(duì)試驗(yàn)?zāi)概＿M(jìn)行處理，試驗(yàn)牛使用的藥品相同，處理流程相同，飼養(yǎng)管理方法相近，通過試驗(yàn)觀察母牛超數(shù)排卵效果。

1.2 試驗(yàn)物品及器材

促卵泡素(FSH)，商品名為舒牛，100 IU/支×10，中國寧波第二激素廠生產(chǎn)；孕酮栓(GIOB)，澳大利亞Vetoquinol N.-A Inc公司生產(chǎn)，1.56 g/枚×10，北京比威克生物技術(shù)有限公司提供；氯前列烯醇鈉(PGF2)，0.2 mg∶2 mL×10支/盒，濟(jì)南齊魯動(dòng)物保健品公司生產(chǎn)；促黃體素釋放激素A3(25 μg×10支)，寧波第二激素廠；沖胚液，1 000 mL/瓶，法國IMV卡蘇公司生產(chǎn)；冷凍液，10 mL/瓶，法國IMV卡蘇公司生產(chǎn)；保存液，10 mL/瓶，法國IMV卡蘇公司生產(chǎn)；鹽酸利多卡因注射液，10 mL×5支)，吉林華牧動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)。程序冷凍儀(型號(hào)CL80000)，澳大利亞Cryologic公司生產(chǎn)；實(shí)體顯微鏡，由德國卡爾蔡司公司(Carl Zeiss)生產(chǎn)，沖胚管、擴(kuò)張品由北京比威克生物技術(shù)有限公司提供；除粘器、集卵杯、塑料注射器(20 mL，50 mL)、無菌培養(yǎng)皿、0.25 mL冷凍細(xì)管、移液器、裝管器等均由南寧基諾公司提供。

1.3 試劑配制

FSH試劑配制：每10 mL生理鹽水溶解100 IU促卵泡素(舒牛)，充分搖勻溶液，試劑即配即用。

1.4 超數(shù)排卵流程

超排方法：選擇發(fā)情周期的任何一天在供體母牛陰道內(nèi)埋植孕酮栓(作為試驗(yàn)第0天)，采用4 d遞減法對(duì)牛肌肉注射FSH(見表1)，每天上、下午2次注射，間隔12 h，第11天上午試驗(yàn)牛注射0.5 mg PG，第12天撤掉試驗(yàn)?zāi)概ｊ幍纼?nèi)的孕酮栓。第13天上午、下午及第14天上午連續(xù)3次輸精，在第13天上午輸精后每頭牛肌注50 mg促黃體素釋放激素A3，第20天對(duì)試驗(yàn)牛子宮進(jìn)行沖洗、收集胚胎、實(shí)驗(yàn)室鏡檢及鑒定分級(jí)。

表1 各組牛FSH 4 d遞減法注射劑量及流程

輸精要求：供體牛經(jīng)過激素處理后，發(fā)情鑒定在第13天進(jìn)入了輸精的環(huán)節(jié)。第13天上午、下午分別對(duì)發(fā)情母牛人工授精，各輸精1次，每次輸2支精液，輸精位置為母牛雙側(cè)子宮角，輸精操作必須輕柔，緩進(jìn)緩出，防止精液倒流及子宮、生殖道受傷，配種后肌肉注射50 μg促黃體素釋放激素A3，如第14天早上發(fā)現(xiàn)有供體母牛發(fā)情，流粘較清，有相互爬跨等現(xiàn)象，還需要再對(duì)母牛輸精1次。

采胚技術(shù)：在試驗(yàn)第20天，即發(fā)情后的第7天，對(duì)試驗(yàn)?zāi)概２捎脝温肥經(jīng)_卵管進(jìn)行非手術(shù)沖卵。先將牛保定好，用2%的普魯卡因或3～5 mL利多卡因行尾椎硬膜外麻醉。用子宮頸黏液去除器吸除黏液，在助手的協(xié)助下，將帶鋼芯的沖卵管插個(gè)陰門，達(dá)到子宮頸口。用直腸把握法將沖卵管緩緩插入子宮頸和子宮角，當(dāng)沖卵管到達(dá)子宮角彎曲處時(shí)，拔出一小部分鋼芯，再將沖卵管往前送，當(dāng)鋼芯再次到達(dá)子宮角彎曲處時(shí)，再拔出一小部分鋼芯，將沖卵管往前送，直到?jīng)_卵管到達(dá)子宮角前端為止，用20 mL的注射器給沖卵管氣囊充氣約12～18 mL，需根據(jù)子宮角的大小確定充氣量，最后拔出鋼芯，用沖卵液沖洗出子宮受精卵(即胚胎)，回收沖卵液，收集胚胎。

胚胎鑒定分級(jí)法：快速鏡檢回收的沖胚液并鑒定胚胎，統(tǒng)計(jì)胚胎總數(shù)、可用胚胎數(shù)、一級(jí)胚胎數(shù)。一級(jí)胚：形態(tài)完整，外形勻稱，呈球形，分裂球細(xì)胞大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊，透明度適中，沒有或只有少量游離細(xì)胞。二級(jí)胚：發(fā)育稍遲緩，有少量游離細(xì)胞(<20%)，細(xì)胞團(tuán)完整，呈球形，細(xì)胞之間結(jié)合緊密。三級(jí)胚胎：發(fā)育遲緩1～2 d，卵裂球大小不均勻，透明度變化明顯(太暗或太明)，游離細(xì)胞較多(20%～50%)，細(xì)胞聯(lián)結(jié)不夠緊密，胚胎呈球形，有明顯的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)。四級(jí)胚胎：發(fā)育遲緩2 d以上，細(xì)胞團(tuán)破碎，細(xì)胞死亡退化，為不可用胚胎。一、二級(jí)胚胎可用于鮮胚移植和冷凍保存，三級(jí)胚胎只能用于鮮胚移植，不能用于冷凍保存，一、二、三級(jí)胚胎為可用胚胎。

1.6 測(cè)定項(xiàng)目與統(tǒng)計(jì)方法

依據(jù)胚胎鑒定分級(jí)法對(duì)各組回收的胚胎進(jìn)行鑒定分級(jí)，統(tǒng)計(jì)各組總的胚胎數(shù)、可用胚數(shù)、一級(jí)胚數(shù)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用LSR法q檢驗(yàn)對(duì)各組平均數(shù)進(jìn)行差異性顯著性檢驗(yàn)，并依據(jù)下列公式計(jì)算可用胚率和一級(jí)胚胎率?？捎门呗?可用胚胎數(shù)÷總胚胎數(shù)×100%，一級(jí)胚胎率=一級(jí)胚胎數(shù)÷總胚胎數(shù)×100%，采用2個(gè)樣本百分?jǐn)?shù)差異顯著性檢驗(yàn)(t法)分別對(duì)各組可用胚率和一級(jí)胚率作差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 西門塔爾母牛超數(shù)排卵獲胚胎情況

據(jù)表2，試驗(yàn)?zāi)概＋@得胚胎最高14枚，最低3枚，平均數(shù)(8.02±2.75)枚，都安組產(chǎn)胚最高，頭均(8.50±2.58)枚，4組間無顯著差異(P>0.05)。數(shù)據(jù)表明，西門塔爾母牛對(duì)外源激素的作用有良好的應(yīng)答，試驗(yàn)方法適用，試驗(yàn)取得良好的效果。

表2 西門塔爾母牛超數(shù)排卵獲胚數(shù)量 枚

2.2 西門塔爾母牛超數(shù)排卵獲可用胚和一級(jí)胚情況

本次試驗(yàn)?zāi)概ｎ^均獲可用胚1～9枚，平均(4.64±1.84)枚；一級(jí)胚為0～3枚，平均(1.56±0.94)枚；可用胚率20%～77.78%，平均為57.89%；一級(jí)胚率0～33.33%，平均19.49%，可用胚、一級(jí)胚等結(jié)果與國內(nèi)同行水平比較相當(dāng)?？捎门邤?shù)、一級(jí)胚數(shù)、可用胚比率、一級(jí)胚比率組間無顯著差異(P>0.05)，但都安組在獲得可用胚數(shù)、一級(jí)胚數(shù)及一級(jí)胚率上均優(yōu)于其余三組，分別高出平均值6.47%，16.03%和9.39%。大化組總胚和可用胚數(shù)不高，但是可用胚比率是最高的，優(yōu)質(zhì)胚胎比例大，比最低組提高了8.07%，。筆者認(rèn)為，規(guī)模化程度較高的牛場(chǎng)在選擇優(yōu)秀母牛方面有較大的優(yōu)勢(shì)，優(yōu)秀母牛獲得胚胎的數(shù)量和質(zhì)量要優(yōu)于普通母牛，另外，飼養(yǎng)管理和日糧營養(yǎng)水平對(duì)母牛獲得胚胎質(zhì)量均有影響，以上分析可能是各組超排效果存在差別的原因。

表3 4組西門塔爾母牛超數(shù)排卵效果分析

3 討 論

影響牛超排效果的因素較多，牛的品種、營養(yǎng)水平、超排處理方法、激素種類及沖胚技術(shù)的嫻熟度等對(duì)超排效果均有影響[1-3，6-7]。試驗(yàn)采用GIOB+FSH+PGF2處理廣西4組西門塔爾肉牛，超數(shù)排卵的效果還是比較好的，比寧財(cái)?shù)炔捎萌毡具M(jìn)口FSH處理錦江牛獲得胚胎數(shù)5.8枚和可用胚3.8枚稍高[5]，與薛仰全等采用CUE+MATE孕酮栓+FSH+PGF2α處理奶牛獲得頭均可用胚4.86枚相當(dāng)[3]。FSH劑量可以影響胚胎數(shù)量和質(zhì)量，在實(shí)踐中掌握牛的胎次及年齡，確定合適的FSH劑量方能達(dá)到較好的超排效果[2，6，8]。營養(yǎng)和環(huán)境因素對(duì)超排母牛也有影響[3，10-12]，應(yīng)盡量規(guī)避和降低不良應(yīng)激因素對(duì)牛體的影響。本次4組試驗(yàn)牛用藥和處理方法相同，飼養(yǎng)管理相仿，但所處的環(huán)境不同，采胚操作不是同一人完成，牛個(gè)體對(duì)激素應(yīng)答反應(yīng)有差異，均可能是超排效果有差別的原因。

4 結(jié) 論

(1)試驗(yàn)采用孕酮栓(GIOB)+促卵泡素(FSH)+氯前列烯醇(PGF2)的方法對(duì)廣西西門塔爾肉牛超數(shù)排卵效果良好，獲得的總胚胎數(shù)、可用胚數(shù)及可用胚率與國內(nèi)同行超排數(shù)據(jù)相近，試驗(yàn)結(jié)果為今后肉牛繁育技術(shù)的更廣泛開展提供參考。

(2)廣西的規(guī)模牛場(chǎng)已具備完善的牛超數(shù)排卵、胚胎移植的條件，基本掌握牛同期發(fā)情、超數(shù)排卵及胚胎移植等技術(shù)及流程，但在技術(shù)細(xì)節(jié)上還需要加強(qiáng)和提高，主要表現(xiàn)在試驗(yàn)牛的選擇和沖胚技術(shù)方面。在實(shí)際生產(chǎn)中，一些牛場(chǎng)在選擇超排試驗(yàn)?zāi)概r(shí)，只要認(rèn)為牛只表面健康、無明顯的繁殖性疾病就選定為試驗(yàn)?zāi)概?，筆者認(rèn)為這樣欠妥，試驗(yàn)前應(yīng)當(dāng)查看牛只配種檔案，挑選體格健康、情期受胎率高、繁殖性能優(yōu)良的母牛作為超數(shù)排卵母牛，才能確保繁育技術(shù)的高效和穩(wěn)定。另外，沖胚技術(shù)的嫻熟度對(duì)胚胎回收率和母牛健康有很大影響，生產(chǎn)實(shí)踐中也應(yīng)加強(qiáng)和提高。